[发明专利]一种提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株

权利要求书

1.一种提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株，其特征在于：包括如下步骤：

构建质粒：选择目标基因插入到毕赤酵母分泌型质粒中，构建出带有目标基因的目标质粒。

出发菌株构建：将目标质粒电转化到毕赤酵母中，筛选高拷贝菌株作为出发菌株；

敲除质粒构建：设计敲除基因对应的gRNA和对应的引物，并将gRNA插入到质粒中构成缺陷质粒；

单敲除菌株构建：提取毕赤酵母基因组，将敲除基因上下游的引物融合在一起制得donner DNA，然后将缺陷质粒和donner DNA通过电转化的方式转入感受态细胞中。

阳性克隆子筛选：PCR验证纯化阳性转化子。

2.根据权利要求1所述的一种提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株，其特征在于：还包括如下步骤：选择阳性克隆子筛选中制得的纯化阳性转化子再经过单敲除菌株构建和阳性克隆子筛选制得双敲除菌株阳性转化子，其中第一次单敲除菌株构建和第二次单敲除菌株构建中，敲除的基因并不相同。

3.根据权利要求1所述的一种提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株，其特征在于：所述第一次单敲除单敲除菌株构建和第二次单敲除菌株构建中，第一次敲除的基因为VPS10-1Δ、第二次敲除的基因为VPS10-2Δ或第一次敲除的基因VPS10-2Δ、第二次敲除的基因为VPS10-1Δ。

4.根据权利要求1所述的一种提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株，其特征在于：所述质粒为毕赤酵母甲醇诱导分泌型质粒pPIC9K。

5.根据权利要求1所述的一种提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株，其特征在于：所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。

6.根据权利要求1所述的一种提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株，其特征在于：所述单敲除菌株构建中敲除的基因为VPS10-1Δ或VPS10-2Δ。

7.根据权利要求6所述的一种提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株，其特征在于：所述单敲除菌株构建中敲除的基因为VPS10-2Δ。

8.根据权利要求6或7中所述的一种提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株，其特征在于：所述VPS10-1Δ对应的sgRNA-VPS10-1序列为GCAGGAGGTTATTACACCTG。

9.根据权利要求6或7中所述的一种提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株，其特征在于：所述VPS10-2Δ对应的sgRNA-VPS10-2序列为GCCATCATGGTAGACAACGC。

10.根据权利要求1所述的一种提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株，其特征在于：所述电转化为质粒、donner DNA与感受态细胞置于电转杯中静置5min，再通过电转化的方式转入感受态中。