[发明专利]一种提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株

说明书

本发明提供了一种提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株，其包括如下步骤：构建质粒、出发菌株构建、敲除质粒构建、单敲除菌株构建、阳性克隆子筛选，其中选择的菌株为毕赤酵母，敲除的基因为VPS10和或VPS10‑2Δ，本发明提供的制得的加工后菌株有着较高的产量和酶活，能够显著改善人源溶菌酶目前产量和酶活严重不足的情况。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种提高人源溶菌酶产量及酶活的 毕赤酵母缺陷型菌株。

背景技术

溶菌酶由于其抗菌性、抗病毒、提高免疫力等特性而作为一种新型抗菌肽 受到了广泛关注。与传统的抗生素不同，溶菌酶可以水解细菌细胞壁的β-1，4 糖苷键，破坏细胞壁的结构使细菌溶解死亡，因此不必担心细菌的耐受性问题。 并且溶菌酶能够有效杀死微生物而保护自身不受损伤，因此在畜牧业、食品产 业、临床医学等方面广泛应用。也引起世界卫生组织、粮食农业组织的关注。

溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水 解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一种能水解细菌中黏多糖的碱性酶。 溶菌酶可分为c型、g型和p型。人源溶菌酶属于c型溶菌酶，由130个 氨基酸组成，其相对分子量为14700。相比其他类型溶菌酶。人源溶菌酶具有 酶活力高、热稳定性高等优点，并且是人体内源蛋白质。而由于原料来源和纯 化成本等原因，人源溶菌酶的制备量无法满足各领域的需求。目前存在多种利 用真核或原核宿主生产人源溶菌酶的方式，但是在酶活和产量上属于不能让人 满意的状态。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较 佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或 省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略 不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有溶菌酶生产方法中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明其中一个目的是，克服现有溶菌酶生产方法的不足，提供一种提 高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方 案：一种提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株，其特征在于：包 括如下步骤：

构建质粒：选择目标基因插入到毕赤酵母分泌型质粒中，构建出带有目标 基因的目标质粒。

出发菌株构建：将目标质粒电转化到毕赤酵母中，筛选高拷贝菌株作为出 发菌株；

敲除质粒构建：设计敲除基因对应的gRNA和对应的引物，并将gRNA插 入到质粒中构成缺陷质粒；

单敲除菌株构建：提取毕赤酵母基因组，将敲除基因上下游的引物融合在 一起制得donner DNA，然后将缺陷质粒和donner DNA通过电转化的方式转入 感受态细胞中。

阳性克隆子筛选：PCR验证纯化阳性转化子。

作为本发明所述提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株的一 种优选方案，其中：还包括如下步骤：选择阳性克隆子筛选中制得的纯化阳性 转化子再经过单敲除菌株构建和阳性克隆子筛选制得双敲除菌株阳性转化子， 其中第一次单敲除菌株构建和第二次单敲除菌株构建中，敲除的基因并不相 同。

作为本发明所述提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株的一 种优选方案，其中：第一次单敲除单敲除菌株构建和第二次单敲除菌株构建中， 第一次敲除的基因为VPS10-1Δ、第二次敲除的基因为VPS10-2Δ或第一次敲除 的基因VPS10-2Δ、第二次敲除的基因为VPS10-1Δ。

作为本发明所述提高人源溶菌酶产量及酶活的毕赤酵母缺陷型菌株的一 种优选方案，其中：质粒为毕赤酵母甲醇诱导分泌型质粒pPIC9K。