[发明专利]刀鲚性腺体细胞系的建立及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体为刀鲚性腺体细胞系的建立及应用。步骤包括：(1)分离和消化刀鲚的性腺组织，取细胞铺板培养；(2)细胞贴壁后进行传代，连续培养45‑60代。所获得的刀鲚性腺体细胞系能够稳定传代和增殖，并且能够诱导鱼类精原干细胞在体外分化产生精子。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为刀鲚性腺体细胞系的建立及其应用。

背景技术

性腺对脊椎动物的繁殖至关重要，性腺由生殖细胞、支持细胞和间质细胞组成，支持细胞和间质细胞统称为体细胞。生殖细胞最终发育产生配子，支持细胞包裹着生殖细胞，促进生殖细胞的生长、发育和配子产生，支持细胞紧靠间质细胞。几种细胞之间相互作用，维持性腺的正常发育和生理机能。

精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)是精子发生的基础，对遗传信息的传递至关重要。鱼类和其他两性生殖动物一样，其SSCs具有高度的自我更新和分化能力，为精子产生提供了稳定的生殖细胞来源。精子发生是一个复杂的过程，经历了干细胞更新和分化的有丝分裂期、减数分裂期和精子发生后的减数分裂期。在体外完全重现精子发生非常复杂且不稳定，一方面需要获得能够稳定培养的正常精原干细胞系，另一方面需要模拟精子发生的体内微环境，高效诱导SSCs发生减数分裂产生精母细胞，以及后续精子细胞形变产生精子。

精子发生受到各种内源和外源信号的共同调控。内源因子包括几种重要的生殖细胞标记分子，如dnd、piwi等，它们的缺失都会导致不育；外源信号包括各类激素、生长因子等，它们通过调节支持细胞的活性、结构以及性类固醇产生，从而调节生殖细胞的发育和分化。另外，支持细胞上存在着一些分子，能够与生殖细胞上的受体相互作用，在生殖细胞的自我更新和分化过程中必不可少。因此，性腺体细胞与生殖细胞之间存在着紧密联系，二者在鱼类性腺的有效发育和配子发生过程中缺一不可。有研究表明，将青鳉精原干细胞与虹鳟性腺体细胞混合培养，可诱导青鳉精原干细胞体外精子发生，但由于混合后细胞成分复杂，一定程度上限制了鱼类精子发生机制的相关研究。

基于性腺体细胞在精子发生过程中的重要作用，获得稳定培养的性腺体细胞系对探究鱼类精子发生过程至关重要。探究鱼类的精子发生，不仅有利于干细胞生物学的基础研究，对濒危珍稀鱼种的保护，缩短性成熟周期长的经济鱼类的育种周期也有重要价值。

发明内容

本发明旨在提供一种建立刀鲚性腺体细胞系的方法。

本发明还提供了上述刀鲚性腺体细胞系的应用。

技术方案为，一种建立刀鲚性腺体细胞系的方法，包括以下步骤：

(1)分离和消化刀鲚的性腺组织，取细胞铺板培养；

(2)细胞贴壁后进行传代，连续培养45-60代。

优选的，在步骤(2)中，连续培养50代获得刀鲚性腺体细胞系。

优选的，所述的刀鲚为长江刀鲚。

以含有羟乙基哌嗪乙硫磺酸的DMEM培养基为基础培养基，并含有胎牛血清、青鳉鱼胚胎提取物、海鲈鱼血清、碱性成纤维细胞生长因子、L-谷氨酸、非必要氨基酸；培养条件为：27-30℃培养。

青鳉鱼胚胎提取物的制备方法为：收取发育至5-8天的青鳉鱼胚胎进行研磨，收集研磨物，液氮中冻融2-4次后继续研磨，将研磨物在10000-15000g条件下，1-4℃离心15-40min，收集上清；用pH＝7.0-7.4的PBS对胚胎提取物进行溶解并定容。优选的，收取发育至7天的青鳉鱼胚胎进行提取。

海鲈鱼血清的制备方法为：抽取海鲈鱼血(从海鲈鱼尾静脉抽血)，室温静置1-4h后，转移至4℃放置8-12h，然后4000-8000g、1-4℃离心20-40min，收集上清。