[发明专利]一种生产菜油甾醇的酿酒酵母工程菌及构建方法

权利要求书

1.一种酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌敲除了C-22甾醇去饱和酶Erg5，并且表达来源于Pangasianodonhypophthalmus的7-脱氢胆固醇还原酶。

2.如权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述7-脱氢胆固醇还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。

3.如权利要求1或2所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母BY4742为宿主细胞。

4.如权利要求3所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌还包括启动子，所述启动子为强化7-脱氢胆固醇还原酶的表达；所述启动子为PGK1p、GPM1p、TDH3p、TEF1p、TPI1p、GPD1p、TEF2p、ACT1p、GAL1p和TDH2p中的一种或多种。

5.权利要求1~4任一所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）表达盒的构建：将整合位点上游同源臂，酵母启动子，7-脱氢胆固醇还原酶基因，酵母终止子，整合位点下游同源臂构建得到7-脱氢胆固醇还原酶表达盒元件；将得到的7-脱氢胆固醇还原酶表达盒元件以及含有Cas9蛋白的敲除质粒通过酵母转化的方式导入到酵母细胞体内，通过酵母自身的同源重组完成元件的组装进而得到完整的表达盒；

（2）将上述表达盒插入到酿酒酵母BY4742酵母染色体ChrXI上的1114a位点，并敲除C-22甾醇去饱和酶成功构建得到酿酒酵母工程菌。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酵母启动子为PGK1p、GPM1p、TDH3p、TEF1p、TPI1p、GPD1p、TEF2p、ACT1p、GAL1p和TDH2p中的一种或多种。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述酵母终止子为ADH1t。

8.一种生产菜油甾醇的方法，其特征在于，采用权利要求1~4任一所述的酿酒酵母工程菌制备菜油甾醇。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，将酿酒酵母工程菌接种至种子培养基中，制备得到种子液；将种子液转接至发酵培养基中，收集培养后的细胞，加入皂化反应液，反应结束后加入正己烷萃取，制备得到菜油甾醇。

10.权利要求1~4任一所述的酿酒酵母工程菌在制备菜油甾醇及含有菜油甾醇的产品中的应用。