[发明专利]一种生产菜油甾醇的酿酒酵母工程菌及构建方法

说明书

本发明公开了一种生产菜油甾醇的酿酒酵母工程菌及构建方法，属于基因工程和生物工程领域。本发明通过将7‑脱氢胆固醇还原酶的表达盒元件导入到酵母细胞体内，利用CRISPR/Cas9基因操作系统整合至酵母基因组中，还敲除了C‑22甾醇去饱和酶，解除麦角固醇分支途径的竞争，实现了从葡萄糖到菜油甾醇的酵母合成。本发明的方法工艺简单，绿色环保，可用于发酵生产菜油甾醇。采用本发明提供酿酒酵母工程菌株BY4742‑Δerg5‑TEF1p‑dhcr7‑ADH1t制备得到的菜油甾醇的产量，在摇瓶阶段可达253.35mg/L，发酵罐水平产量可达916.88mg/L，比菌株在摇瓶阶段菜油甾醇的产量提升了2.6倍。

技术领域

本发明涉及一种生产菜油甾醇的酿酒酵母工程菌及构建方法，属于基因工程和生物工程领域。

背景技术

近年来，甾体药物因具备良好的抗炎、抗过敏和避孕等作用而备受生物医药行业的高度重视，甾体激素类药物的市场需求一直居高不下，成为仅次于抗生素的第二大药物。随着人们对甾体激素类药物的需求不断增加，全球甾体激素药物的生产工艺经历了数次变革，包括化学全合成、植物提取皂素加化学半合成、新型微生物合成等多个阶段，直至今日，甾体激素药物的合成工艺仍在不断探索与创新。菜油甾醇是甾体药物(孕酮、雄烯二酮、氢化可的松等)的一种重要合成前体，也是植物来源的主要甾醇之一。其与动物来源的主要甾醇(胆固醇)的结构仅在C24位多出一个甲基，与微生物来源的主要甾醇(麦角甾醇)的区别在于C7-8和C22-23位是饱和单键。因此，这为微生物催化法生产菜油甾醇提供了可行性的理论基础。

目前，甾体类药物主要通过化学合成和生物催化两种主要方式进行生产。由于化学合成法会造成严重的环境污染且中间步骤复杂，因此，生物催化因其绿色环保且反应过程简易而受到了极大的关注。然而，由于甾体类药物及其中间体水溶性较差，难以进出细胞被利用，造成了生物催化生产甾体类药物的较低生物转化率。虽然有添加助溶剂以及将底物溶解于有机溶剂中进行添加等方法来提高微生物对底物的利用率，但转化率仍然不是很高。随着合成生物学的发展，利用微生物合成菜油甾醇等具有高价值药物的前体化合物已成为一种发展趋势。微生物合成具有周期短，产量高，条件温和，环保和过程可控等特点，因此可作为新型的生产甾体药物的生产方式。

酵母细胞体内存在着一条天然的甾醇合成途径，因此可作为合成甾体药物的优良底盘细胞。现有技术当中，虽然存在采用酵母细胞生产菜油甾醇的报道，但是，由于途径中(如图3所示)的关键酶7脱氢胆固醇还原酶DHCR7的活性不高，进而限制了菜油甾醇的高效生产。因此，如何得到一种高效生产菜油甾醇的方法，成为研究的热点。

发明内容

技术问题

本发明要解决的技术问题是，提供一种高效生产菜油甾醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法，及利用酿酒酵母工程菌高效生产菜油甾醇的方法。

技术方案

为了解决上述问题，本发明提供了一种酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌敲除了C-22甾醇去饱和酶Erg5，并且含有来源于Pangasianodon hypophthalmus的7-脱氢胆固醇还原酶。

在本发明的一种实施方式中，所述7-脱氢胆固醇还原酶的氨基酸序列如SEQ IDNO 1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述7-脱氢胆固醇还原酶的核苷酸序列如SEQ IDNO 2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述C-22甾醇去饱和酶基因的氨基酸序列如SEQ IDNO 3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述C-22甾醇去饱和酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO 4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母BY4742为宿主细胞。