[发明专利]一种BAX纳米抗体库及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种BAX纳米抗体，其特征在于，所述BAX纳米抗体的序列选自如SEQ ID NO:3、SEQID NO:5-17、SEQ ID NO:19-24所示的其中一种；

所述BAX纳米抗体的制备方法包括以下步骤：

（1）将BAX抗原蛋白通过皮下注射的方式，对羊驼进行4次免疫，免疫间隔为14天，免疫剂量分别为2mg、1mg、0.5mg、0.5mg；再收集羊驼外周血液，分离得到淋巴细胞；

（2）提取所述淋巴细胞的总RNA，反转录扩增cDNA，再经过巢式PCR对cDNA进行扩增，得到目的基因VHH；

（3）将所述目的基因VHH与载体连接，并转化至感受态细胞，构建VHH基因文库；

（4）从所述VHH基因文库中取活细胞进行接种培养，采用噬菌体进行培养，纯化噬菌体，得到噬菌体展示文库；

（5）对所述噬菌体展示文库进行筛选，得到阳性克隆，可制得所述BAX纳米抗体。

2.根据权利要求1所述的BAX纳米抗体，其特征在于，步骤（2）所述巢式PCR共有两轮，包括：

（1）以cDNA为模板进行第一轮扩增，所扩增的产物进行分离纯化，备用

（2）利用第一轮所扩增的产物进行第二轮扩增，扩增得到目的基因VHH，分离纯化；

所述第一轮扩增和第二轮扩增中所用引物相同，所述引物的核苷酸序列为：

Primer For：5’-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCGAGTCTGGRGGAGG-3’（SEQ ID NO:1），

Primer Rev：5’-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGGAGACGGTGACCWGGGT-3’（SEQ IDNO:2）。

3.根据权利要求2所述的BAX纳米抗体，其特征在于，步骤（2）所述巢式PCR中，第一轮扩增的体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，2.5mM dNTP mixture 4μL，10mM Primer For 1μL，10mM Primer Rev 1μL，cDNA 1μL，Ex Taq 0.5μL，H₂O补足到50μL；

第二轮扩增的体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，2.5mM dNTP mixture 4μL，10mMPrimer For 1μL，10mM Primer Rev 1μL，第一轮所扩增的产物 1μL，Ex Taq 0.5μL，H₂O补足到50μL。

4.根据权利要求2所述的BAX纳米抗体，其特征在于，步骤（2）所述巢式PCR中，第一轮扩增的反应条件为98℃ 10s；50℃ 15s；72℃ 1min；重复30个循环；第二轮扩增的反应条件为98℃ 10s；55℃ 15s；72℃ 30s；重复25个循环。

5.根据权利要求1所述的BAX纳米抗体，其特征在于，步骤（3）所述VHH基因文库的构建方法，包括以下步骤：

将所述目的基因VHH和载体pComb3xss采用SfiI酶切，将酶切后的VHH和pComb3xss采用T4 DNA连接酶连接后，转化至TG1电穿孔感受态细胞中，构建得到VHH基因文库。

6.根据权利要求1所述的BAX纳米抗体，其特征在于，步骤（5）中所述噬菌体展示文库进行筛选的方法，包括以下步骤：

（1）包被：向96孔酶标板中加入浓度50μg/mL的GST Tag N/A融合蛋白，4℃过夜；

（2）封闭：加入3%BSA，37℃封闭1h；

（3）抗原和噬菌体孵育：加入100μg/mL、50μg/mL的BAX GST融合蛋白，4℃过夜；加入所述噬菌体展示文库悬液100μL，弃上清液，用0.1%PBST洗板5次、0.1%PBS洗板5次；

（4）清洗：弃上清液，用0.1%PBST、0.1%PBS洗板；

（5）洗脱：加入100μL Gly-HCL洗脱缓冲液进行洗脱，室温8min，洗脱两次；

（6）将洗脱的噬菌体重复筛选过程2次，得到阳性克隆，可制得所述BAX纳米抗体。