[发明专利]一种BAX纳米抗体库及其制备方法与应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种BAX纳米抗体库及其制备方法与应用。其制备方法包括以下步骤：(1)使用BAX抗原对羊驼进行免疫后，收集外周血液，分离得到淋巴细胞；(2)提取淋巴细胞的总RNA，反转录扩增cDNA，再经过巢式PCR对cDNA进行扩增，得到目的基因VHH；(3)将目的基因VHH与载体连接，并转化至感受态细胞，构建VHH基因文库；(4)从VHH基因文库中取活细胞进行接种培养，采用噬菌体进行培养，纯化噬菌体，得到噬菌体展示文库；(5)对噬菌体展示文库进行筛选，得到BAX纳米抗体库。所述BAX纳米抗体具有抑制肿瘤细胞生长的作用，可用于制备肿瘤细胞抑制剂或抗肿瘤药物。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种BAX纳米抗体库及其制备方法与应用。

背景技术

BAX是与BCL-2同源的水溶性相关蛋白，是BCL-2基因家族中细胞凋亡促进基因，该基因编码的BAX蛋白可与BCL-2形成异二聚体，对BCL-2产生阻抑作用，是极重要的促进细胞凋亡基因之一。此外，BAX的表达较为广泛，可出现在肝细胞、肾小管上皮细胞、呼吸系上皮细胞和支气管平滑肌、血管平滑肌细胞中。细胞凋亡在肿瘤发生、发展及治疗中起重要作用，而BAX基因作为人体最主要的凋亡蛋白，可促进肿瘤细胞凋亡，能明显提高化疗药物以及放疗杀伤肿瘤细胞的敏感性。

单域抗体是骆驼科动物和软骨鱼体内的一种天然缺失重链但仍然具有生物活性的特异性抗体，其抗原结合点(VHH)具有独立的抗原识别能力，独立表达的VHH又称为纳米抗体。纳米抗体是目前天然来源的相对分子质量最小的抗体。由于传统的抗体分子质量过大，肿瘤组织穿透能力差，会造成肿瘤区域的有效浓度较低，治疗效果不充分，并且具有很高的免疫原性。而与普通抗体相比，纳米抗体分子量小，结构简单，易于基因操作和克隆，抗原特异性好，使得纳米抗体在新药物发现方面表现出巨大的潜力。同时纳米抗体和靶点结合特异性更强，组织穿透力更高，稳定性更高，适合工业化大规模生产，更容易体外改造和优化，更容易人源化。纳米抗体技术在疾病治疗诊断和肿瘤的靶向治疗中具有很大的发展前景。

因此，希望提供一种BAX纳米抗体库的构建方法，从而制得能抑制肿瘤细胞生长的BAX纳米抗体。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种BAX纳米抗体库及其制备方法与应用，所述BAX纳米抗体具有抑制肿瘤细胞生长的作用，可用于制备肿瘤细胞抑制剂或抗肿瘤药物。

一种BAX纳米抗体库的制备方法，包括以下步骤：

(1)使用BAX抗原对羊驼进行免疫后，收集羊驼外周血液，分离得到淋巴细胞；

(2)提取所述淋巴细胞的总RNA，反转录扩增cDNA，再经过巢式PCR对cDNA进行扩增，得到目的基因VHH；

(3)将所述目的基因VHH与载体连接，并转化至感受态细胞，构建VHH基因文库；

(4)从所述VHH基因文库中取活细胞进行接种培养，采用噬菌体进行培养，纯化噬菌体，得到噬菌体展示文库；

(5)对所述噬菌体展示文库进行筛选，得到阳性克隆，即为BAX纳米抗体库。

优选的，步骤(1)中将BAX抗原蛋白通过皮下注射的方式，对羊驼进行4次免疫，免疫间隔为14天，免疫剂量分别为2mg、1mg、0.5mg、0.5mg。

采用间接ELISA法测定每轮免疫后羊驼抗血清效价，用PBS溶液稀释BAX GST至2μg/ml，加入96孔酶标板中，4℃过夜；PBST洗板3次；加入4％脱脂乳，37℃封闭1h；PBST洗板3次；用PBS溶液倍比稀释每一轮免疫后的羊驼抗血清，分别加入96孔酶标板中，37℃孵育30min；加入稀释至1/10000的Goat anti-llama IgG(HRP)，37℃孵育30min；PBST洗板3次；加入TMB显色液，37℃孵育5min；终止反应，读取酶标仪数值。