[发明专利]一种体外培养原代神经肌肉接头的方法

权利要求书

1.一种体外培养原代神经肌肉接头的方法，其特征在于，包括如下步骤：获取原代成肌细胞，将原代成肌细胞接种于多聚赖氨酸包被的多孔培养板中，进行成肌细胞分化培养，待成肌细胞分化为成熟肌细胞后，再获取原代脊髓运动神经元，将原代脊髓运动神经元接种于所述多孔培养板中，继续培养，形成成熟的原代神经肌肉接头。

2.根据权利要求1所述的一种体外培养原代神经肌肉接头的方法，其特征在于，所述原代成肌细胞以及原代脊髓运动神经元取自SD大鼠；获取原代成肌细胞的步骤为：新生1天的SD大鼠，75％乙醇消毒，断头处死；无菌条件下取四肢，去除皮肤，取腓肠肌，去除脂肪、肌腱等结缔组织，4℃预冷的L15培养基冲洗组织3次，将肌肉组织剪成1mm³左右的碎块，转移至离心管中，1000rpm离心2min，去除上清液，重复该步骤3次去除上清液及漂浮组织；随后加入0.1％I型胶原酶消化25min，其间摇晃数次，弃胶原酶，再用0.25％胰蛋白酶消化55min，其间亦摇晃数次，加入DMEM完全培养基终止消化，反复吹打后，吸取上清，如此三次，收集所有上清，1000rpm离心5min，DMEM完全培养基重悬，分别采用200和400目的筛网过滤；收集滤液，1000rpm离心10min，弃上清，DMEM完全培养基重悬细胞；将细胞悬液加入未经多聚赖氨酸处理的培养皿中，置于37℃，5％CO₂培养箱中静置60～80min后，轻轻振摇尚未贴壁的成肌细胞，收集至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，DMEM完全培养基调整细胞密度为1.0×10⁵/ml，将500μl细胞悬液接种于多聚赖氨酸包被的24孔培养板中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，约3～4天待细胞密度达到70％～80％后，换成肌细胞分化培养基继续培养5～7天；

获取原代脊髓运动神经元的步骤为：胚胎13.5天SD大鼠，麻醉下颈椎脱位处死；75％乙醇消毒后，快速取出胚胎，转移到L15培养基中；解剖显微镜下，分离椎骨、获取脊髓，用0.125％胰蛋白酶37℃消化0.5h，消化完成后加入完全培养基终止消化，吹打组织10次，收集上清，如此吹打三次，直至所有组织块消失，收集所有上清，在1100rpm下离心5min后，将细胞沉淀轻轻悬浮在L15培养基中，并用200目筛网过滤，获得单细胞悬液；加入等体积的密度梯度离心液；在2000rpm下离心20min后，提取中间相并与等体积完全培养基混合；在1100rpm下离心6min后，用完全培养基重新悬浮细胞。

3.根据权利要求2所述的一种体外培养原代神经肌肉接头的方法，其特征在于，所述肌细胞完全培养基为DMEM+20％FBS+1％PS；所述肌细胞分化培养基为DMEM+2％HS+1％PS+10nM insulin；所述神经元完全培养基为DMEM+10％FBS+1％PS；所述密度梯度离心液为4.165ml-E培养基+0.75ml OptiPrep^TM+0.085ml B27。

4.根据权利要求2所述的一种体外培养原代神经肌肉接头的方法，其特征在于，将原代脊髓运动神经元接种于所述多孔培养板中，继续培养的步骤为：采用完全培养基调整原代脊髓运动神经元密度至2.0×10⁵/ml，将500μl接种到肌细胞培养24孔板中，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养，大约4h待细胞贴壁后，换成神经元生长培养基，所述神经元生长培养基为NB+2％B27+1％Glutamax+1％PS+5ng/ml BDNF，继续培养7天，形成成熟的原代神经肌肉接头。

5.一种基于微流体装置的体外培养原代神经肌肉接头的方法，其特征在于，包括如下步骤：获取原代脊髓运动神经元以及原代成肌细胞，将这两种细胞接种于微流体装置的两个不同腔室中，采用不同的培养条件分别培养，并利用流体差促进运动神经元和骨骼肌细胞通过微通道中的轴突连接，从而建立微流体原代神经肌肉接头模型。