[发明专利]一种体外培养原代神经肌肉接头的方法

说明书

本发明提供一种体外培养原代神经肌肉接头的方法，首先获取原代脊髓运动神经元以及原代成肌细胞，将这两种细胞接种于微流体装置的不同腔室中。采用不同的培养条件分别培养，并利用流体差促进运动神经元的轴突通过微通道向骨骼肌细胞腔室生长，与骨骼肌细胞接触形成成熟的NMJ，实现对细胞的时空控制，有助于研究运动神经元胞体、轴突和NMJ的局部活动。本发明使用原代脊髓运动神经元和原代成肌细胞，原代细胞更好地模拟完整脊髓以及骨骼肌的生理组织。该共培养条件下能够建立成熟的、功能性神经肌肉接头模型，此模型更接近体内条件，为NMJ的体外生物学研究提供了一个有效的、可测量的系统，在药物发现、个体化医学和探索疾病病理学方面将有很好的应用。

技术领域

本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种体外培养原代神经肌肉接头的方法等。本发明可用于研究涉及运动神经元和肌肉通讯生物学的细胞和分子机制，包括轴突生长和引导、突触形成和肌肉收缩活动的神经元刺激等。

背景技术

运动神经元(motoneurons，MN)在不同的细胞外微环境中长距离延伸轴突，与肌肉形成突触——神经肌肉接头(neuromuscular junction,NMJ)。NMJ的形成和维持依赖于内部和外部信号，这些信号需要在时空上与特异性和保真度结合。这种MN肌肉交流对于NMJ的形成和维持，以及MN的存活和正常功能至关重要。这种细胞间通讯的改变可导致突触破坏和轴突生成，是神经退行性变的关键步骤。这个双向通讯过程由粘附因子和分泌因子共同完成，并通过配体-受体机制介导。然而，这些信号的性质以及调节NMJ结构/功能的具体分子机制仍有待进一步了解。特别是对神经元和肌肉之间的逆向和顺行信号传导机制知之甚少。破译这些机制的许多困难是由于在亚细胞水平上研究这些复杂的细胞内和细胞间通讯的技术挑战。

NMJ体外模型建立的最大挑战是培养从不同环境中获得的脊髓运动神经元和骨骼肌细胞这两种不同类型细胞的复杂性。两种类型细胞在单独培养时通常需要不同的培养条件(培养基、生长和分化因子)，这种复杂性使得很难在体外建立NMJ共培养模型。例如，肌肉和神经元的不同生长特性需要合适的培养基，而培养基又应允许神经元的生长和肌肉的分化。因此，研究人员只能通过以下方法体外获得NMJ：①将干细胞或转基因细胞进行体外诱导、分化为运动神经元以及骨骼肌细胞，再共培养形成NMJ；②采用运动神经元样杂交细胞系(NSC-34)或成肌细胞株(C2C12、L6)等进行体外诱导、分化为运动神经元以及骨骼肌细胞，再共培养形成NMJ。然而，干细胞诱导过程复杂、经历时间漫长、各种干细胞诱导因子大多价格昂贵，使得第一种方法难以推广普及。而细胞株为单克隆化的细胞群体。细胞株只能视为具有或保留了某种特性的、有生命活性的实验材料，与原代培养细胞相比，生物特性较差，不能完全模拟组织的固有结构。此外，大多数研究都是在静态培养基上进行的，这些培养基不能再现生物系统中遇到的动态流动条件，缺乏对细胞微环境(包括扩散和流体流动)的精确控制。因此，需要开发NMJ的改进模型来克服这些问题。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种微流体原代脊髓运动神经元-骨骼肌细胞共培养模型，以解决现在技术中的原代神经肌肉接头无法建立的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种体外培养原代神经肌肉接头的方法，包括如下步骤：获取原代成肌细胞，将原代成肌细胞接种于多聚赖氨酸包被的多孔培养板中，进行成肌细胞分化培养，待成肌细胞分化为成熟肌细胞后，再获取原代脊髓运动神经元，将原代脊髓运动神经元接种于所述多孔培养板中，继续培养，形成成熟的原代神经肌肉接头。