[发明专利]一种用于核酸片段化的酶组合物及其应用

说明书

本发明提供了一种用于核酸片段化的酶组合物及其应用，所述酶组合物包括用于片段化核酸的核酸内切酶和用于修复粘性末端的DNA聚合酶，还包括用于消化原始样本或反应过程中产生的单链，核酸内切酶、DNA聚合酶和核酸外切酶集中在一个反应体系中，在一定的浓度范围内相互配合，实现了对核酸样本的高效片段化切割，同时避免了额外单链的产生，构建的文库进行二代测序，获得的测序数据颠倒嵌合假阳性突变率低，解决了现有片段化酶法文库构建方法的测序数据单核苷酸位点变异或基因嵌合突变率假阳性背景高的问题，在文库构建领域具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于核酸片段化的酶组合物及其应用，尤其涉及一种用于核酸片段化的酶组合物及其在文库构建中的应用。

背景技术

自人类基因组计划完成以来，测序技术得到了快速的发展。近年来，以二代测序技术(Next-generation sequencing，NGS)为主的高通量测序成本大幅下降，高通量测序市场迅速增长。随着高通量测序技术逐渐标准化和规范化，该技术已广泛应用于常规临床实践，应用领域包括无创产前检测(NIPT)、胚胎植入前遗传学筛查(PGS)、胚胎植入前遗传学诊断(PGD)、疾病筛查、肿瘤和药物基因组检测、病原微生物检测等。

目前，肿瘤NGS检测主要对体细胞突变来源的肿瘤进行分析(即肿瘤伴随诊断)，如非小细胞肺癌、结直肠癌等。通过NGS分析肿瘤中的突变基因，为肿瘤的靶向治疗提供依据，同时也为肿瘤分子分型、预后评价、耐药性分析和复发监测等提供有效信息。肿瘤NGS检测还用于筛查生殖细胞变异引起的遗传性肿瘤综合征，如遗传性乳腺癌，通过对具有肿瘤家族背景史的趋向者进行检测，有利于将肿瘤防治措施前移至预防阶段。肿瘤NGS检测还广泛应用于液体活检领域，大量研究证实，肿瘤患者的外周血中含有游离肿瘤DNA(ctDNA)，ctDNA取材方便，是潜在的肿瘤个体化诊断、预后和复发风险评估标志物。国内外先后发布了非小细胞癌ctDNA检测指南，为临床开展ctDNA的NGS检测提供了依据，为肿瘤分子分型和个体化治疗提供了精细化指导。此外，NGS技术还在病原微生物鉴定、法医鉴定和HLA配型等多个领域具有潜在的应用优势，可以同时检测多个样本，成为了强有力的分子诊断工具。

将NGS技术应用于临床肿瘤检测涉及多个流程，主要包括样品制备(核酸提取)、文库构建、上机测序以及数据过滤比对分析四个环节。人类全基因组碱基数约为3G，对临床诊断数据进行分析判定体细胞突变、融合突变类型等，通常需要上千甚至上万乘的覆盖度，使得全基因组测序成本非常高，因此，在文库构建后通常需要进行全部外显子捕获或目标区域捕获。全基因组测序通过对基因组上所有的基因进行测序分析，找到大量的SNV、CNV、Indel、SV(结构变异)、Fusion等基因变异信息，有利于全面解析癌症发生发展的分子机制。而外显组捕获测序主要针对基因组外显子区域的SNV(单核苷酸变异)进行数据分析，分析Indel(插入缺失)、CNV(拷贝数变异)、Fusion等基因变异类型和癌症的相关性。目标捕获测序则对一些功能富集的基因或研究人员感兴趣的基因组的部分区域进行捕获，分析基因变异对癌症的影响。

从NGS技术应用于临床肿瘤检测的整个流程来看，文库构建是最重要的环节之一。将NGS应用于临床诊断领域不仅对文库的构建时间、经济成本以及操作便捷性提出了新的要求，而且对文库下机数据的真实性、SNV、CNV、Indel等指标的检出灵敏度也提出了更高的要求。目前许多第三方检测机构承诺采用NGS进行肿瘤诊断、72小时内出具诊断报告，意味着72小时内需完成样本制备、DNA预文库构建、靶向富集、上机测序、数据分析和临床诊断报告出具等步骤，对实验操作时间和操作便捷性均有非常高的要求，因此越来越多的检测机构在预文库构建环节采用片段化酶法来代替传统的机械打断法。