[发明专利]一种构建KLF12高表达小鼠的方法及在构建非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的应用

说明书

本发明公开了一种构建KLF12高表达小鼠的方法及在构建非叶酸依赖的神经管缺陷(neural tube defects,NTDs)小鼠模型的应用，其包括根据Klf12基因序列，利用Cre‑loxP基因重组技术，构建Rosa26^Klf12/Klf12小鼠；将所述Rosa26^Klf12/Klf12小鼠与Sox^Cre雌鼠交配，获得的KLF12高表达胚胎即为非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型，该小鼠模型可以应用在筛选治疗候选药物、保健品的制备或研发中。本发明首次构建高水平KLF12所致非叶酸依赖的NTDs动物模型，该模型与人类非叶酸依赖的NTDs患者类似，具有很好的临床症状模拟性，稳定性高，十分利于进行机理研究和药物筛选。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种构建Krüppel-like factor 12(KLF12)高表达小鼠的方法及在构建非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的应用。

背景技术

神经管缺陷(neural tube defects,NTDs)是一种常见的胎儿严重畸形，因妊娠前四周神经管未能完全闭合所致。根据解剖学特点，NTDs主要分为无脑儿、脊膨出、脑膨出和脊柱裂等类型。人们已经证实，叶酸能够参与DNA修复、核苷酸合成和甲基化反应等生物学过程，其缺乏是造成NTDs的主要原因之一。得益于叶酸服用的普及，我国 NTDs发生率由1996年的13.6/万，下降至2011年的4.5/万。虽然成效显著，但由于我国人口基数大，每年新增NTDs总例数仍然庞大，这些补充叶酸仍不能避免发生的NTDs 病例给家庭和社会造成了严重负担，是全面实现“健康中国”亟待解决的问题之一，有待进一步研究。因此，为了针对非叶酸依赖的NTDs实施有效的诊断及治疗，开发用于非叶酸依赖的NTDs的机理研究与治疗方法研究的生物样本，也就需要合适的动物模型。

Cre-LoxP系统是由一个单一的Cre重组酶和被称为LoxP序列的靶向基因敲除序列组成。Cre重组酶有70％的重组效率，不借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA 底物，如线形、环状甚至超螺旋DNA。它是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP 位点(序列)之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。Cre-LoxP重组系统可用于分析转基因动物模型的表型和基因型之间的关系，Cre重组酶可以识别LoxP序列，通过DNA重组的原理，可以将两个LoxP序列之间的片段 去除。如果没有Cre，LoxP只是在特定的基因片段两侧，不影响基因片段的活性。一旦Cre酶有活性，就可以把LoxP中间所夹的序列去除，即条件性基因敲除。Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况：

1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；

2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个 LoxP位点间的序列倒位；

3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。

但目前现有技术中对于非叶酸依赖的NTDs动物模型的开发和选择还比较少，且效果不够稳定，因此开发一种具有较高临床症状模拟性且较为稳定的非叶酸依赖的NTDs 动物模型对筛选候选药物具有重要的意义。

发明内容

发明目的：目前利用高温、高糖或维甲酸等诱导NTDs小鼠模型的方法成功率均不够稳定，为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种建立非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的方法及应用，目的在于对于KLF12高表达的胚胎，该胚胎能够100％出现非叶酸依赖的NTDs表型，可为进一步进行机理研究和药物筛选提供稳定的模型。