[发明专利]调控强度弱化的酵母菌启动子及其在代谢通量调控中的应用

说明书

本发明公开了一种调控强度弱化的酵母启动子及其应用。本发明具体地公开了一种DNA分子，所述DNA分子是在酵母内源启动子上整合具有阻遏作用的异源顺式调控元件，获得的调控强度降低或减弱的重组启动子。本发明通过整合marO序列可有效下调酵母启动子的强度，从转录水平降低基因表达水平，为酵母代谢工程改造中下调支路途经、分解途径或衍生途径等的代谢通量提供新的工具。将该启动子弱化策略应用于酵母角鲨烯衍生途径的弱化中，可有效降低从角鲨烯到甾醇的代谢通量。本发明提供的产角鲨烯的酵母菌株，可在不额外添加酶抑制剂特比萘芬或其他效应物的条件下，实现角鲨烯的高效积累，降低发酵成本，简化发酵工艺，具有很好的工业化应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程和代谢工程领域中调控强度弱化的酵母菌启动子及其在代谢通量调控中的应用。

背景技术

酵母菌是现代生物技术领域非常重要的细胞工厂，在生物能源、大宗化学品、精细化学品及生物医药等领域有着非常广泛的应用。以酵母菌为底盘细胞，通过不同策略重构、改造和优化代谢通路，是实现目标代谢产物高效合成的重要手段。

转录调控是控制基因表达水平和相关蛋白质活性的关键调控环节，利用强效启动子增强目标代谢产物合成相关基因的表达是代谢工程改造中最通用和有效的技术手段，因此对不同来源的启动子进行筛选和改造获得调控强度更高的启动子一直是本领域的研究热点。但生物体内的代谢并不是独立的直线型途径，而是存在多个分支、相互依存的复杂网络模式，一味地提高关键基因的表达水平并不一定能实现目标产物产量的持续提高，其合成途径中需要各个基因的相互协调和配合，需要实现各个基因表达水平的平衡。因此除利用强效启动子增强目标产物合成代谢相关基因的表达外，还需要利用合适的启动子降低分支、分解或衍生途径相关基因的表达，通过对多基因表达的协同调控提高代谢工程改造的效率，在不影响底盘细胞生理功能的前提下实现目标代谢产物合成的最大化和有效积累。

目前，在酵母菌启动子改造研究中主要靶向提高启动子调控强度，并且取得了很好的研究进展。但对如何有效降低启动子调控强度的研究还非常有限，在下调支路途经、分解途径或衍生途径的代谢通量方面还缺乏有效的调控工具。因此有必要基于合成途径分支的这一特点，通过弱化启动子的调控强度来抑制或下调目标途径的竞争途径，从而实现目标代谢产物的高效积累。角鲨烯(squalene)是一种具有抗氧化、增强机体免疫力、抗肿瘤等多种生理活性的不饱和三萜化合物，在医药、保健品、食品和化妆品等领域有着广阔的市场前景。角鲨烯是酵母菌甾醇合成途径的中间代谢产物，它在角鲨烯单加氧酶ERG1催化下很快被转化为甾醇合成的前体，因此天然酵母细胞中角鲨烯的含量极低。而ERG1基因是酵母菌生长的必需基因，不能采用敲除ERG1基因的策略阻断角鲨烯向甾醇的代谢通路，因此要在不影响细胞生长的基础上实现角鲨烯的有效积累就必须对角鲨烯单加氧酶ERG1的活性水平进行合理调控。在基因表达调控中，阻遏蛋白能够与靶基因启动子的特定序列发生特异性结合，从而减弱或阻断基因的转录，因此利用阻遏蛋白结合序列对酵母菌启动子进行改造可能是弱化启动子调控强度的有效方法。而为了避免内源阻遏蛋白对调控系统的干扰，异源阻遏系统的调控元件可能更具有优势。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何有效降低启动子的调控强度，为酿酒酵母代谢工程改造中下调支路途经、分解途径或衍生途径等的代谢通量提供新的工具，从而实现目标代谢产物的高效积累。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种DNA分子，其名称为pSW，所述DNA分子是在酵母内源启动子上整合具有阻遏作用的异源顺式调控元件，获得的调控强度降低或减弱的重组启动子。

所述整合选自下述至少一种：

A1)在所述酵母内源启动子中插入所述异源顺式调控元件，

A2)用所述异源顺式调控元件替换所述酵母内源启动子中的DNA片段。

进一步地，本发明所述异源顺式调控元件具体可为大肠杆菌阻遏蛋白MarR的DNA结合序列marO，所述marO的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。