[发明专利]一种胰岛素和白介素-10双基因修饰重编程间充质干细胞及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及干细胞基因治疗领域，具体涉及一种胰岛素和白介素‑10双基因修饰重编程间充质干细胞及其制备方法与应用。所述双基因修饰的间充质干细胞为过表达胰岛素和白介素‑10的间充质干细胞，其制备方法包括：（1）构建嵌合胰岛素和白介素‑10双基因的重组质粒表达载体；（2）用所构建的重组质粒转染骨髓间充质干细胞；（3）克隆筛选得到过表达胰岛素和白介素‑10的MSC细胞株。本发明所公开的胰岛素和白介素‑10双基因修饰重编程间充质干细胞具有分泌胰岛素和免疫调节双重功能，移植到实验性糖尿病小鼠体内可恢复胰岛素正常水平并保持血糖稳定。本发明用于胰岛素依赖型糖尿病的基因治疗。

技术领域

本发明涉及干细胞基因治疗领域，特别涉及一种胰岛素和白介素-10双基因修饰的重编程间充质干细胞及其在糖尿病基因治疗领域的应用

技术背景

糖尿病是一类严重的代谢疾病，严重危害人类健康,尽管皮下注射胰岛素、口服降糖药等可以缓解糖尿病患者的高血糖，但是这些治疗措施只是暂时性的，并不能从根本上彻底治疗糖尿病以及阻止其他并发症的发生。随着人们对糖尿病本质的深层次揭示和现代分子生物学基因工程技术手段的发展，应用基因治疗手段将胰岛素基因直接导入体细胞，替代β细胞功能分泌胰岛素，避免细胞的自身免疫损伤，成为根本上治愈由胰岛素分泌缺乏引起的糖尿病未来发展方向。

胰岛素依赖型糖尿病的基因治疗策略：胰岛素依赖型糖尿病的主要病理生理特点是胰岛β细胞功能减退和缺失导致体内胰岛素缺乏。其基因治疗策略有两个方面：第一是增补体内分泌胰岛素的细胞，从而增加胰岛素的分泌量；第二是改善或避免破坏β细胞的免疫应答，保护残留等β细胞免受自身免疫反应的损伤。基于上述两个目的，基因治疗的对应策略包括(1)基因增补：指将正常的功能胰岛素基因以一定的基因转移方式导入患者体内，表达出患者体内缺失的胰岛素，重新赋予其正常的血糖调节生理功能；（2）免疫耐受的缺失导致胰岛β细胞受损是胰岛素依赖型糖尿病的病因, 指诱导免疫耐受的免疫调节因子以一定的基因转移方式导入患者体内特定靶细胞，抑制自身免疫对β细胞的损伤，起到保护胰岛细胞的作用。白细胞介素-10（Interleukin-10, IL-10）作为重要的抑制性细胞因子，主要由Th2 细胞分泌，能抑制由Th1 分泌的 IL-1β、IL-6、IFN-γ及 TNF-α等细胞因子的合成，减弱这些细胞因子导致的胰岛素分泌抑制、β细胞凋亡和外周胰岛素抵抗，在 T胰岛素依赖型糖尿病的的发生过程中扮演重要作用。

干细胞基因治疗：细胞替代治疗和基因治疗很关键的问题是选择一种能满足要求以及来源容易的种子细胞。间充质干细胞 ( mesenchymalstemcells, MSCs) 是来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，具有自我复制能力和多向分化能力，可修复做种组织器官损伤，是干细胞基因治疗的优选种子细胞。作为基因工程种子细胞具有如下优越性: ① MSCs来源广泛, 易于分离培养, 有增殖趋势, 且生命周期长,体内外均能保持多向分化的潜能, 遗传背景相当稳定 ;②离体细胞较易受外源遗传物质转染, 并能长期稳定表达该遗传物质 ;③ MSCs经过转染和一定时间的体外培养后再输回体内仍能成活, 并能迁移到病变部位 ;④MSCs的MHC抗原发育不完全，抗原性弱，移植后不会发生免疫排斥反应。间充质干细胞易于外源基因的转染和表达, 且MSC所携带的外源基因表达具有明显的组织特异性。MSC作为一种新型的基因治疗的载体细胞有着广泛临床应用前景。间充质干细胞成为基因治疗的重要种子细胞之一。

本发明以基因治疗胰岛素依赖型糖尿病为目的，设计构建一种胰岛素(Insulin,INS)和白介素-10(IL-10)双基因修饰的编程间充质干细胞，使这种基因重组间充质干细胞表达胰岛素和免疫调节因子IL-10，从而起到分泌胰岛素和发挥免疫调节的双重作用。

发明内容

针对胰岛素依赖型糖尿病的治疗长期依赖注射胰岛素维持生命，无法从根本上治愈糖尿病的重大技术难题，本发明的目的在于提供一种可以表达胰岛素和白介素-10的双基因修饰重编程间充质干细胞及其制备方法，为从根本上治疗糖尿病提供干细胞基因治疗新药物和方法。

其具体技术方案如下。