[发明专利]第二链引导

说明书

本文提供了第二链引导，其通过一种对测序平台特异性cDNA扩增子测序的方法实现，该方法包括：提供测序平台特异性扩增子，其中所述测序平台特异性扩增子包含双链多核苷酸，所述双链多核苷酸包含：i)包含SEQ ID NO：1的第一末端；ii)包含SEQ ID NO：2的第二末端；和iii)包含双链cDNA多核苷酸的中间区域，所述双链cDNA多核苷酸包含与mRNA序列互补的第一链cDNA多核苷酸，所述第一链cDNA多核苷酸与对应于所述mRNA序列的第二链cDNA多核苷酸杂交；并且用含有SEQ ID NO：8的第二测序引物从第二末端对扩增子测序。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年8月5日提交的美国临时申请号62/371,638和2017年6月20日提交的美国临时申请号62/522,232的优先权，其全部内容通过引用纳入本文用于所有目的。

背景技术

高通量测序正在彻底改变生物学的许多领域，包括癌症诊断，疾病监测和环境分析。特别地，通过逆转录的cDNA的高通量测序分析mRNA分子的方法可以揭示在给定时刻生物样品中转录物的种类和数量。因此，剪接，转录后修饰，基因融合，突变和基因表达的变化都可以通过单一方法监测。

常用的高通量测序平台(例如由亿明达(Illumina)，罗氏测序(RocheSequencing)，太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)等提供的平台)的输入材料由侧翼为平台特异性衔接子(adaptor)的转录组衍生的DNA片段的复杂文库组成。构建此类文库的标准方法完全在体外进行，通常包括cDNA合成，DNA片段化(机械或酶促)，末端抛光，衔接子序列连接，基于凝胶的大小选择，和PCR扩增中的一种或多种或全部。根据具体应用，该核心方案可以在其他步骤之前。然而，目前用于产生cDNA的方法在两端用衔接体(adapter)标签化，所述衔接体与当前可用的高通量测序平台相容，所述方法通常具有低产率，缺乏再现性，高成本等缺点或其组合。

发明内容

一方面，本发明提供了一种标签化cDNA多核苷酸的方法，该方法包括：-提供双链mRNA：cDNA杂合体，其包含具有5′末端和3′末端的第一链cDNA多核苷酸并与具有5′末端和3′末端的互补mRNA杂交，其中第一链cDNA多核苷酸的5′末端包含第一衔接体序列或其互补序列；-合成与第一链cDNA多核苷酸互补并与第一链cDNA多核苷酸杂交的一种或多种第二链cDNA多核苷酸，其中合成包括：i)使mRNA：cDNA杂合体与包含RNA酶H活性的酶接触，从而产生与第一链cDNA杂交的mRNA片段，和ii)使mRNA片段与DNA聚合酶接触，从而在模版引导的聚合酶反应中延伸mRNA片段，其中模板是第一链cDNA多核苷酸并形成双链cDNA多核苷酸；-任选地使一种或多种第二链cDNA多核苷酸与DNA连接酶接触；-使双链cDNA多核苷酸与载有衔接体的标签酶接触，从而形成包含标签化的双链cDNA多核苷酸的反应混合物，所述标签化的双链cDNA多核苷酸包含第一末端和第二末端，其中第一末端包含第一衔接体序列及其互补序列，并且第二末端包含第二衔接体序列及其互补序列，-其中mRNA的5′末端是单链的；或者，-其中mRNA的5′末端包含DNA：RNA杂合体，并且其中该方法包括在反应混合物中扩增标签化的双链cDNA，所述反应混合物包含与第一末端杂交的第一扩增引物和第二和第三扩增引物，其中第二或第三扩增引物与第二末端杂交；或者，-其中，双链cDNA多核苷酸与载有衔接体的标签酶的接触在含有载有同型衔接体的标签酶的反应混合物中进行，所述反应混合物不含有具有不同衔接体的载有衔接体的标签酶。

在一些实施方式中，mRNA的5′末端是单链的。在一些实施方式中，该方法还包括通过使标签化的双链cDNA多核苷酸与第一扩增引物和第二扩增引物接触，从反应混合物中选择性地扩增标签化的双链cDNA多核苷酸，其中第一扩增引物选择性地与第一衔接体序列杂交并且包含第一测序平台特异性衔接体序列，并且其中第二扩增引物选择性地与第二衔接体序列杂交并包含第二测序平台特异性衔接体序列，从而产生测序平台特异性cDNA扩增子。