[发明专利]一种通过灰度值计算微生物单元数浓度的方法

权利要求书

1.一种通过灰度值计算微生物单元数浓度的方法，其特征在于，包括：根据待测样品中待测微生物的核酸的目的基因PCR扩增产物的灰度值，以及不同浓度的质粒标准品的起始拷贝数浓度与各个质粒标准品的PCR扩增产物灰度值的函数关系，计算得到待测样品中待测微生物的单元数浓度，各个质粒标准品中含有对应微生物的目的基因。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在含有荧光试剂的PCR扩增反应体系中，分别对所述待测样品中待测微生物的核酸、各质粒标准品进行PCR扩增反应，得到结合有所述荧光试剂的PCR扩增产物。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述荧光试剂选自SYTO-82、SYTO-9、SYTO-13、SYBR Green I、SYBR Gold、EvaGreen中的至少一种。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对各个PCR扩增产物进行拍照，获得待测样品中待测微生物的核酸的目的基因PCR扩增产物的灰度值、各质粒标准品的PCR扩增产物的灰度值；

和/或，待测样品中待测微生物的核酸、各质粒标准品的PCR扩增体系及PCR扩增反应条件完全相同；

和/或，PCR扩增反应体系中还含有热稳定的DNA聚合酶及其缓冲液、用于特异性扩增目的基因的引物；

和/或，所述热稳定的DNA聚合酶选自Ex-Taq酶、Taq酶、Pyrobest DNA聚合酶中的至少一种；

和/或，PCR扩增反应体系中还含有dNTP。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR扩增反应的循环数≥20；

和/或，PCR扩增反应的循环数为23-40；

和/或，每个循环反应如下：94-95℃，5-30s；60-65℃，5-30s；

和/或，PCR扩增反应还包括在循环反应之前进行预变性；

和/或，预变性步骤的温度为94-95℃，时间为1-5min。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸、质粒标准品均为DNA分子；

和/或，所述核酸为提取自待测微生物的DNA分子；

和/或，所述核酸为由提取自待测微生物的RNA分子逆转录得到的DNA分子；

和/或，所述待测样品中，单个待测微生物单元中的目的基因的拷贝数是已知的；

和/或，所述目的基因包括rRNA基因；

和/或，所述rRNA基因是指某一沉降系数的rRNA基因；

和/或，所述rRNA基因选自16S rRNA基因、5S rRNA基因、23S rRNA基因、28S rRNA基因、5.8S rRNA基因、18S rRNA基因中的至少一种；

和/或，如果所述微生物为细胞型微生物，则所述待测微生物的单元数浓度是指细胞个数浓度；

和/或，如果所述微生物为非细胞型微生物，则所述待测微生物的单元数浓度是指拷贝数浓度。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，各质粒标准品的起始拷贝数浓度是已知的；

和/或，所述不同浓度的质粒标准品是指不同起始拷贝数浓度的质粒标准品；

和/或，所述不同浓度的质粒标准品是由原始质粒标准品稀释至不同的拷贝数浓度得到；

和/或，所述不同浓度包括不同的浓度梯度；

和/或，不同起始拷贝数浓度的质粒标准品的拷贝数指数梯度为1-7。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，根据待测样品中待测微生物的核酸的目的基因PCR扩增产物的灰度值，以及不同浓度的质粒标准品的起始拷贝数浓度指数与各个质粒标准品的PCR扩增产物灰度值的函数关系，计算得到待测样品中待测微生物的单元数浓度。