[发明专利]大豆皱叶症抗性鉴定的KASP分子标记及应用

说明书

本发明涉及农业生物学技术领域，具体公开了一种用于大豆皱叶症抗性鉴定的KASP分子标记及应用。所述KASP分子标记引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，该KASP分子标记能够实现对大豆皱叶症抗性进行高效、准确、低成本鉴定及基因分型，鉴定检测有效性达99.58%，准确度达到100%。

技术领域

本发明属于农业生物学技术领域，特别涉及大豆皱叶症抗性鉴定的KASP分子标记及应用。

背景技术

广西、广东、福建、贵州等地生产上出现的一种大豆叶片皱缩现象，这种皱叶症状表征为：叶脉间有明显的“皱褶”，叶片上有边缘不明显的淡黄色斑，叶缘微黄，叶片难以伸展，主叶脉顶部向下弯曲，整片叶片呈“勾手”状，叶片基部较叶片顶部症状轻。据调查，该症状在生产上早已存在，只是以前多被误认为病毒病所致；皱叶症为环境中某中未知因子诱发所致，在某些地点可以稳定出现；皱叶在大豆种质间存在较大的差异，且可稳定遗传，皱叶严重时可使大豆减产20-30％，选育抗皱叶症大豆品种对发展南方大豆生产有着重要的意义。

由于皱叶症出现受环境影响，且生长中期才表现性状，单纯的依靠表型鉴定，不仅耗时长，而且具有一定的局限性。而DNA分子标记技术具有不受环境影响、不受发育阶段、技术简单快速等特点而被广泛用于育种，加快育种的进度有选择的有效性。随着测序技术的发展，不仅测序的成本大大降低，而且可以获得大量的SNP和INDEL数据，为开发和目标基因紧密连锁的分子标记进行高通量标记检测提供了便利。KASP即竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR)，原理上和TaqMan检测方法相似，但它基于独特的ARM PCR原理，使用通用荧光引物进行位点检测，而不需要每个SNP位点都合成特异的荧光引物，因此成本低且可实现高通量检测，KASP标记检测技术已在医学、农学等领域得到广泛应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于大豆皱叶症抗性鉴定的KASP分子标记及应用，从而实现对大豆皱叶症抗性进行高效、准确、低成本鉴定及基因分型

为实现上述目的，本发明提供了一种用于大豆皱叶症抗性鉴定的KASP分子标记引物，所述KASP分子标记引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示

另一方面，提供了大豆皱叶症抗性的基因分型方法，通过提取大豆基因组DNA，用SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的KASP标记引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增。

进一步，所述PCR扩增方法为：

PCR反应体系：DNA 2.5μL、KASP引物混合物0.07μL、2×KASP Master mix 2.5μL。

PCR反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20s，61-55℃梯度PCR，每循环降低0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃复性及扩增60s，共26个循环。

所述的KASP引物混合物包括FAM上游引物、HEX上游引物、通用下游引物和纯水

进一步，所述KASP引物混合物由浓度均为100μM的FAM上游引物、HEX上游引物、通用下游引物与纯水按6:6:15:23体积比混合而成。

再一方面，上述的大豆皱叶症抗性鉴定的KASP分子标记引物在大豆皱叶症抗性鉴定中的应用。

进一步，所述鉴定方法如下：

(1)获得待测样品基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，利用上述的KASP分子标记引物进行竞争性等位基因特异性PCR反应扩增；

(3)PCR反应结束后，收集每个反应孔产生的荧光信号，根据荧光信号的类型判断分子标记的基因型，进而鉴定出待鉴定个体的皱叶症抗性。