[发明专利]一种铜离子诱导重组蛋白表达体系及其诱导方法和应用

说明书

本发明公开了一种铜离子诱导重组蛋白表达体系及其诱导方法和应用，属于基因和蛋白工程领域。本发明通过基因工程将大肠杆菌铜耐受基因copA的启动子序列PcopA和重组蛋白的编码基因进行融合，并利用pUC57‑Kan载体转化到copA和cueO基因均被敲除的大肠杆菌体内，向培养基中添加外源铜离子即可高效诱导和表达重组蛋白。本系统具有很强的抗干扰能力，其他杂质或强酸条件不会影响重组蛋白的表达效率，所以可以利用含有铜离子的工业废水进行重组蛋白的诱导，达到节能减排、实现资源回收利用的目的，具有良好的推广价值和应用前景。

技术领域

本发明涉及基因和蛋白工程领域，特别是涉及一种铜离子诱导重组蛋白表达体系及其诱导方法和应用。

背景技术

利用基因工程和蛋白质工程技术在表达宿主体内制备和获取重组蛋白是目前应用十分广泛的技术。目前商业化的重组蛋白表达质粒，一般都需要添加诱导剂才能高效诱导蛋白表达，比如IPTG、阿拉伯糖等，这些诱导剂相对比较昂贵，尤其是在制备工业级数量的重组蛋白时，成本较高。虽然目前已有一些无需添加诱导剂的自诱导方法被报道，但一般这些自诱导方法需要使用专门的自诱导培养基(添加额外化合物)，配制起来仍显繁琐。此外，如果需要制备某种金属作为辅基的重组蛋白时，诱导时需要往培养基中添加相应的金属溶液。

细菌等微生物在进化过程中衍生出一套能够对抗环境中高浓度重金属毒性作用的自我保护机制。以铜离子为例，大肠杆菌(E.coli)体内存在一套铜耐受cop操纵子。当E.coli处在高浓度铜离子环境中时，cop系统被激活，其中的CopA和CueO蛋白被大量诱导表达，CopA的作用是将细胞质内的铜离子向周质泵出，CueO的作用是在周质内将Cu⁺氧化为Cu²⁺，防止周质内铜离子进入细胞质，这样可以将细胞质内的铜离子浓度控制在较低水平。如果将cop系统的功能基因序列替换成重组目的蛋白编码序列，保留copA上游的启动子序列，将可以利用铜离子作为诱导剂进行重组蛋白的高效表达。而且，如果制备铜离子为辅基的蛋白质时，更为简便、廉价，仅添加铜离子即可得到活性蛋白。由于此系统的抗干扰能力很强，使用含有其他杂质的含铜工业废水同样能够有效诱导重组蛋白表达。

目前没有利用微生物的重金属耐受机制及原理进行重组蛋白诱导表达的相关报道。而为了降低重组蛋白制备成本，且同时实现除污减排，利用细菌重金属耐受机制的优势发明一种新的重组蛋白诱导方法，将对改进现有技术产生相当重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种铜离子诱导重组蛋白表达体系及其诱导方法和应用，只需要添加铜离子溶液或工业含铜废水，不需要使用其他诱导剂，即可高效诱导重组蛋白表达。该方法具有成本低廉、绿色环保的特点，具有广泛的应用前景。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

第一方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体中包括加入优化的MCS序列的copA启动子序列，所述加入优化的MCS序列的copA启动子序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，提供了一种包含所述的表达载体的宿主大肠杆菌，其特征在于，所述的宿主大肠杆菌中copA和cueO基因被双敲除。

第三方面，提供了一种铜离子诱导的重组蛋白表达体系，所述的表达体系包括所述的宿主大肠杆菌和所述的表达载体。

第四方面，提供了一种铜离子诱导重组蛋白表达的方法，所述方法步骤包括：

1)将目的蛋白的编码序列克隆到所述的表达载体中；

2)得到的表达载体转化入所述的宿主大肠杆菌中过夜生长；

3)过夜生长的菌株加入培养基中培养至对数生长期；

4)再向菌株培养基中添加含铜离子液体进行诱导。