[发明专利]一种基于调控信号通路的小鼠模型的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建β-catenin敲除、Notch1敲除、以及两者双敲除的小鼠模型。在鼠龄为0或1天的时候，注射tamoxifen与EdU，鼠龄为7天时，解剖所述小鼠的基底膜进行免疫荧光实验，用myosin7a抗体标记毛细胞，用Sox2抗体标记支持细胞，并且对EdU+Sox2与EdU+Myo7a均阳性的细胞进行计数统计；

分别分离野生型对照组、β-catenin过表达(β-cat OE)、Notch1-KO以及β-cat OE/Notch1-KO鼠龄7天天小鼠基底膜，分别提取其RNA进行测序；

构建Atoh1过表达的小鼠，注射tamoxifen，小鼠取出基底膜进行免疫荧光实验，用myosin7a抗体标记毛细胞，用Sox2抗体标记支持细胞，并且对于EdU/Myo7a双阳性的细胞进行计数统计；

通过抑制YAP的表达调控Hippo信号通路，成球实验分析Hippo信号通路对表达Lgr5的祖细胞的增殖能力。

2.根据权利要求1所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，还包括以下步骤：

从Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2、Lgr5-EGFP-CreERT2和Foxg1-loxp/loxp均阳性的小鼠耳蜗基底膜消化制成的单细胞悬液中，分选出表达Lgr5的内耳干细胞进行培养，对所述表达Lgr5的内耳干细胞进行细胞成球实验，进行免疫荧光染色检测所述表达Lgr5的内耳干细胞的增殖情况；

对鼠龄为30天的小鼠进行ABR检测；

鼠龄为2天的Sox2-CreERT2阳性；R26SmoM2转基因小鼠耳蜗在PBS培养液中分离培养，并进行新霉素损伤，在所述耳蜗中分离RNA，进行定量实时PCR检测。

3.根据权利要求1所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述分选出表达Lgr5的内耳干细胞的方法为细胞流式分选法。

4.根据权利要求1所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述抑制YAP的方法为：通过verteporfin、dobutamine作为YAP抑制剂抑制YAP表达。

5.根据权利要求2所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述ABR检测的实验条件为：将三个细针电极插入小鼠的颅顶、被测耳朵下方和背部靠近尾巴的位置；产生4kHz、8kHz、12kHz、16kHz、24kHz和32kHz的ABR音点。

6.根据权利要求2所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述耳蜗的培养条件为：在37℃、5％CO2下，分别添加1％N2、2％B27和50μg/ml氨苄青霉素培养于DMEM/F12中。

7.权利要求1～6任一所述的小鼠模型在研究毛细胞再生中的应用。