[发明专利]一种基于调控信号通路的小鼠模型的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于调控信号通路的小鼠模型的构建方法及其应用，属于生物技术领域。一种小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：构建β‑catenin敲除、Notch1敲除、以及两者双敲除的小鼠模型。在鼠龄为0或1天的时候，注射tamoxifen与EdU，鼠龄为7天时，解剖所述小鼠的基底膜进行免疫荧光实验，用myosin7a抗体标记毛细胞，用Sox2抗体标记支持细胞，并且对EdU+Sox2与EdU+Myo7a均阳性的细胞进行计数统计；分别分离野生型对照组、β‑catenin过表达(β‑cat OE)、Notch1‑KO以及β‑cat OE/Notch1‑KO鼠龄7天天小鼠基底膜，分别提取其RNA进行测序。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于调控信号通路的小鼠模型的构建方法及其应用。

背景技术

目前，耳聋问题受到人们的关注。2015年，约有5亿人听力丧失，约占世界人口的6.8％。这些数字远远高于2013年之前公布的估计数字，显示听力损失的人数在逐渐增加，说明全球听力保健的重要性日益突出。另外据WHO2018年数据显示有超过4.32亿成年人和3400万儿童患有致残性听力丧失，使其成为一个影响社会健康和经济的主要负担。听力障碍会导致社交孤立、抑郁和专业能力下降。

目前临床上尚无疗效确切的内耳靶向性药物可用于治疗感音神经性聋。由于哺乳动物耳蜗毛细胞不可再生，因此如何使毛细胞在损伤后修复和再生，从而在根本上治疗感音神经性聋是近年来听觉领域研究的重点。而提供一种非人类的动物模型作为研究与试验平台以表征毛细胞的修复与再生，同样具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提出了一种基于调控信号通路的小鼠模型的构建方法及其应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

构建β-catenin敲除、Notch1敲除、以及两者双敲除的小鼠模型。在鼠龄为0或1天的时候，注射tamoxifen与EdU，鼠龄为7天时，解剖所述小鼠的基底膜进行免疫荧光实验，用myosin7a抗体标记毛细胞，用Sox2抗体标记支持细胞，并且对EdU+Sox2与EdU+Myo7a均阳性的细胞进行计数统计；

分别分离野生型对照组、β-catenin过表达(β-cat OE)、Notch1-KO以及β-cat OE/Notch1-KO鼠龄7天天小鼠基底膜，分别提取其RNA进行测序；

构建Atoh1过表达的小鼠，注射tamoxifen，小鼠取出基底膜进行免疫荧光实验，用myosin7a抗体标记毛细胞，用Sox2抗体标记支持细胞，并且对于EdU/Myo7a双阳性的细胞进行计数统计；

通过抑制YAP的表达调控Hippo信号通路，成球实验分析Hippo信号通路对表达Lgr5的祖细胞的增殖能力；

可选地，还包括以下步骤：

从Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2、Lgr5-EGFP-CreERT2和Foxg1-loxp/loxp均阳性的小鼠耳蜗基底膜消化制成的单细胞悬液中，分选出表达Lgr5的内耳干细胞进行培养，对所述表达Lgr5的内耳干细胞进行细胞成球实验，进行免疫荧光染色检测所述表达Lgr5的内耳干细胞的增殖情况；

对鼠龄为30天的小鼠进行ABR检测；

鼠龄为2天的Sox2-CreERT2阳性；R26SmoM2转基因小鼠耳蜗在PBS培养液中分离培养，并进行新霉素损伤，在所述耳蜗中分离RNA，进行定量实时PCR检测。

可选地，所述分选出表达Lgr5的内耳干细胞的方法为细胞流式分选法。

可选地，所述抑制YAP的方法为：通过verteporfin、dobutamine作为YAP抑制剂抑制YAP表达。