[发明专利]一种同时检测百香果三种病毒的引物组、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种同时检测百香果三种病毒的引物组、试剂盒及方法。本发明通过对夜来香花叶病毒(TeMV)、东亚百香果病毒(EAPV)和烟草花叶病毒(TMV)的引物浓度、退火温度和PCR扩增条件等的优化，提供了一种同时检测百香果三种病原的引物组、试剂盒及方法。本发明实现了对田间复合侵染的百香果样品的快速检测，检测结果可靠、准确、特异性强，并缩短了检测时间，有利于研究田间三种病害的发生程度，在农业生产上具有重要的指导意义，为制定科学的病虫害防控体系提供了理论依据。

技术领域

本发明属于农作物病害诊断和分子生物学技术领域，具体涉及一种同时检测百香果三种病毒的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

百香果(Passiflora edulis)又称西番莲、巴西果、鸡蛋果，属于西番莲科(Passifloracea)西番莲属(Passiflora L.)，是一种多年生热带和亚热带水果，因其水果香味而得名。百香果集食用、药用和观赏价值于一身，具有重要的经济意义。近年来，百香果已成为我国南方的一种重要水果，种植面积在不断扩大。由于百香果为无性繁殖，加上连年种植，各种植区之间苗木销售活动频繁，导致病毒病害迅速蔓延，严重影响了百香果的产量和品质。百香果病毒病害也是巴西、澳大利亚、秘鲁及我国台湾、福建、广西、广东、云南、贵州等地区百香果生产的制约因子。

目前，已报道能侵染百香果的病毒有20多种。其中，夜来香花叶病毒(Telosmamosaic virus，TeMV)和东亚百香果病毒(East Asian Passiflora virus，EAPV)分别于2017年首次在福建省部分地区的百香果上检测到，烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)于2020年首次在广西地区的百香果上检测到。这三种病毒均是近年来在国内首次发现，TeMV和EAPV随后在其他省份的百香果上也有发现，而TMV尚未在其他地区检测到。百香果病毒病典型为害症状为花叶、皱缩和斑驳等。在种植园内，百香果通常不止感染一种病毒，常以两种或两种以上病毒混合侵染，对百香果的品质和产量带来巨大的威胁。特别是近年来福建、广西、广东、海南、四川、云南、贵州等地大规模引种栽培百香果时，只注意到常见的几种病毒，而忽视了对这三种病毒的检测及防控工作，致使病毒病再次成为威胁产业发展的技术障碍。

目前，国内多为对百香果黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、TeMV和EAPV的一种或两种检测方法，尚未发现同时检测TeMV、EAPV和TMV的报道。因此，亟需提供一种检测这三种病毒的多重PCR方法，实现对这三种病毒的同时检测。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明的目的是提供一种同时检测百香果中夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus，TeMV)、东亚百香果病毒(East Asian Passiflora virus，EAPV)和烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)三种病毒的引物组、试剂盒及方法，该方法一次PCR反应，能同时检测百香果中TeMV、EAPV和TMV三种RNA病毒，具有成本低、特异性强的特点，能够准确、高效、灵敏的同时检测多种百香果病毒病样品。

本发明的第一个目的是提供一种同时检测百香果三种病毒的引物组，其包括以下3对引物：

扩增TeMV的特异性引物：

TeMV-F：：5’-AGTTGGGAGGACACAAGCCAG-3’(SEQ ID NO.1)，

TeMV-R：5’-CAACCTCACTGTGTTCAAGAC-3’(SEQ ID NO.2)；

扩增EAPV的特异性引物：

EAPV-F：5’-ACAAAGAGAAAGAAGCCGACA-3’(SEQ ID NO.3)，

EAPV-R：5’-GGACTTTATCAAGCGCACCT-3’(SEQ ID NO.4)；