[发明专利]Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用

权利要求书

1.Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法，其特征在于，包括以下步骤；

一、在野生型小鼠中检测Hippo信号通路成员在耳蜗中的表达情况；

二、在离体实验中研究Hippo信号对流式分选出的内耳干细胞增殖分化的调控机制；

三、在离体实验中研究Hippo和Wnt信号对内耳干细胞的协同调控机制；

四、在活体毛细胞新霉素损伤模型中研究Hippo信号如何调控内耳干细胞，从而促进毛细胞再生；

五、在活体毛细胞新霉素损伤模型中研究Hippo和Wnt信号对内耳干细胞的协同调控机制，以及毛细胞再生所导致的听觉功能修复情况；

六、研究DDK3对内耳干细胞的调控机制，以及毛细胞再生所导致的听觉功能修复情况。

2.根据权利要求1所述的Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法，其特征在于，所述步骤一中的检测方法为：使用RT-PCR、Western blotting、Immunohistochemistry技术方法，在基因和蛋白水平定性定量的检测Hippo信号通路中重要因子Yap1的表达。

3.根据权利要求1所述的Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法，其特征在于，所述步骤二的研究方法为：解剖出Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠耳蜗，制成单细胞悬液后经流式细胞仪筛选出Lgr5阳性内耳干细胞，在筛选的内耳干细胞中应用小分子或者构建的Hippo信号通路中重要分子Yap1的敲减或过表达病毒，调控Hippo或/和Wnt信号通路的活性，从而调节内耳干细胞的增殖与分化，促进毛细胞再生。

4.根据权利要求1所述的Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法，其特征在于，所述步骤三的研究方法为：通过筛选的一些小分子或者构建的Hippo信号通路中重要分子Yap1的敲减或过表达病毒，在体外培养的耳蜗组织胞中调控Hippo信号通路的活性，从而促进损伤的耳蜗组织中毛细胞的再生。

5.根据权利要求1所述的Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法，其特征在于，所述步骤六的研究方法为：从Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠耳蜗基底膜消化制成的单细胞悬液中，利用流式细胞仪分选出Lgr5阳性内耳干细胞进行培养，再通过细胞转染技术下调细胞中Dkk3的表达水平，在体外培养的细胞中，通过成球实验和分化实验，研究Dkk3基因的作用。

6.Hippo在毛细胞再生中的应用，其特征在于，包括如权利要求1-5任一项所述的Hippo信号通路，将Hippo信号通路应用在毛细胞再生中。