[发明专利]Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体的是Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用。Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法，包括以下步骤；一、在野生型小鼠中检测Hippo信号通路成员在耳蜗中的表达情况；二、在离体实验中研究Hippo信号对流式分选出的内耳干细胞增殖分化的调控机制；三、在离体实验中研究Hippo和Wnt信号对内耳干细胞的协同调控机制等。本发明使用Lgr5‑EGFP‑CreERT2工具鼠可使得内耳干细胞(Lgr5阳性细胞)的分离准确且大量，可达到较好的研究前提：分选出的小鼠Lgr5阳性内耳干细胞。此外，在离体实验中研究Hippo信号通路对分选出的内耳干细胞进行成球和分化实验后，可以深入探究Hippo信号通路在调控内耳干细胞增殖/分化及毛细胞再生中的具体作用机制。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的是Hippo调控内耳干细胞增殖分化方法及在毛细胞再生中的应用。

背景技术

听觉是人类最重要的知觉之一，也是语言交流的基础。听觉感知作为语言识别和理解的基础，在人类社会活动起着重要的作用。由于社会经济和工业化的快速发展、人口老龄化不断加剧、耳毒性药物滥用和噪音等环境污染因素，患有不同程度上的耳疾病的人数逐年增长。据WHO 2019年的统计显示全球大约有5％即4.66亿人患有残疾性听力损失，其中3400万是儿童。

听力损失和耳聋已成为严重威胁人类健康和影响人们的生活质量的全球性问题，其中感音神经性耳聋约占耳聋患者的63％。感音神经性耳聋源于耳蜗前庭蜗神经或中枢听觉系统的异常，其主要特征为耳蜗高频区域听力易损性和外毛细胞损伤。目前主要的技术是通过人工耳蜗辅助患者恢复一定的听觉功能，但这也只是治标不治本，此外人工耳蜗植入效果因人而异，但只有部分人可以达到或者接近正常人听力水平。因此如何使内耳毛细胞在损伤和丢失后修复和再生，是近年来听觉领域研究的重点。

近年来的很多研究发现Hippo信号通路关键因子YAP是Wnt信号通路的直接靶基因，Lgr5是一种Wnt信号通路下游的靶基因，在小肠和胃中Lgr5阳性细胞具有成体干细胞的特性。有研究表明，在耳蜗的胚胎发育期，Lgr5表达于将生成感觉上皮的前感觉区域，在新生期Lgr5表达于部分支持细胞，在活体小鼠耳蜗中Lgr5阳性细胞可以分化成为毛细胞，在离体培养中Lgr5阳性细胞可以自我更新形成单克隆细胞群体，并再生新的毛细胞，这都表明在耳蜗中Lgr阳性细胞可以作为内耳干细胞Lgr5阳性内耳干细胞增值并分化成为毛细胞的过程受到多种信号通路的调控，最经典的是受到Wnt信号通路的调控。在耳蜗中激活Wnt信号通路可以促进Lgr5阳性内耳干细胞的增殖，部分增殖后的Lgr5阳性内耳干细胞也可以分化成毛细胞。这就表明Wnt信号可以调控耳蜗Lgr5阳性内耳干细胞的增殖和分化。Hippo信号通路关键因子YAP作为Wnt信号通路的直接靶基因，是否Hippo信号通路通过激活或者抑制某些信号通路，从而促进内耳干细胞的增殖并且分化成为毛细胞。然而，到目前为止，Hippo信号通路在内耳中的研究几乎没有报道。因此我们猜想Hippo信号通路可能也参与哺乳动物内耳毛细胞再生的过程。此外，Dickkopf-3(Dkk3)是一种肿瘤抑制因子，是人类DKK家族中编码分泌蛋白的成员，主要调节经典Wnt/β-catenin信号通路。DKK3拮抗Wnt配体，作为Wnt信号转导途径的负调控因子为人所知。

同时，现有技术存在以下缺陷：

1、内耳干细胞很难获取，分选的效率低：因为小鼠耳蜗干细胞主要存在于毛细胞下面的支持细胞中，但并不是所有的支持细胞都是干细胞，只有部分可以具有再生或者分化为毛细胞的潜能，因此精确并高效的分离获得内耳干细胞是目前的难题；

2、目前研究领域中，针对Hippo信号通路相关作用的研究基础很少，因此相应的专用试剂和药物缺乏；

3、目前临床上常用的助听器和人工耳蜗植入虽然在一定程度上改善了患者的听力，但是其效果完全依赖于残存毛细胞的数量和质量，治标不治本。

发明内容