[发明专利]一种定量检测人参的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种定量检测人参的微滴式数字PCR引物，其特征在于，包括用于扩增人参ITS基因的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列如下所示：

5’-AGTTGCGCCCGAAGCCATTA-3’(SEQ ID NO.1)，

5’-AGACACGGGAGGCCATTATC-3’(SEQ ID NO.2)。

2.一种定量检测人参的微滴式数字PCR探针，其特征在于，包括靶向人参ITS基因的特异性探针，所述特异性探针的核苷酸序列如下所示：

5’-ATCACTCCCTTGCGGGAGTTGA-3’(SEQ ID NO.3)。

3.根据权利要求2所述的微滴式数字PCR探针，其特征在于，所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团优选为FAM、TET、HEX、CY3、JOE、VIC、ROX或CY5中的一种；所述淬灭基团优选为BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、MGB或Eclipse中的一种。

4.一种检测工具，其特征在于，包括权利要求1所述的引物和/或权利要求2-3任一项所述的探针。

5.根据权利要求4所述的检测工具，其特征在于，还包括内参基因的检测材料，所述内参基因为ZW-5.8S基因。

6.根据权利要求5所述的检测工具，其特征在于，所述内参基因的检测材料包括检测内参基因的引物和探针；

所述检测内参基因的引物的核苷酸序列为：

5’-TCGGCTCTCGCATCGATGAAG-3’(SEQ ID No.4)，

5’-GCGCAACTTGCGTTCAAAGAC-3’(SEQ ID No.5)；

所述检测内参基因的探针的核苷酸序列为：

5’-ATGGTTCGCGGGATTCTGCAATTC-3’(SEQ ID No.6)。

7.一种定量检测人参的试剂盒，其特征在于，包括权利要求4-6中任一项所述的检测工具。

8.一种定量检测人参的微滴式数字PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取样品DNA；

(2)以所述样品DNA为模板，加入权利要求7中所述试剂盒中的引物和探针、ddPCRSuper Mix和蒸馏水，配置得到反应体系；

(3)将步骤(2)配制的反应体系和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴发生器中生成微滴；

(4)进行扩增反应，反应结束后进行微滴荧光数据分析。

9.根据权利要求8所述的微滴式数字PCR方法，其特征在于，步骤(2)的反应体系包括以下组分：2×ddPCR Super Mix 10μL、10μmol/L上下游引物各1.8μL、10μmol/L探针0.5μL、样品DNA 2μL、采用灭菌蒸馏水补足至20μL。

10.根据权利要求8所述的微滴式数字PCR方法，其特征在于，步骤(4)中扩增反应的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火延伸1min，40个扩增；98℃下10min使酶失活。