[发明专利]一种定量检测人参的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法

说明书

本发明属于分子生物学检测领域，公开了一种定量检测人参的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法。所述引物的核苷酸序列如下所示：5’‑AGTTGCGCCCGAAGCCATTA‑3’(SEQ ID NO.1)，5’‑AGACACGGGAGGCCATTATC‑3’(SEQID NO.2)。所述探针的核苷酸序列如下所示：5’‑ATCACTCCCTTGCGGGAGTTGA‑3’(SEQ ID NO.3)。采用上述特异性引物和探针能够对人参进行定量检测，并具有良好的特异性和灵敏性。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，特别涉及一种定量检测人参的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

人参是五加科、人参属多年生草，喜阴凉、湿润的气候，多生长于昼夜温差小的海拔500-1100米山地缓坡或斜坡地的针阔混交林或杂木林中。由于根部肥大，形若纺锤，常有分叉，全貌颇似人的头、手、足和四肢，故而称为人参。古代人参的雅称为黄精、地精、神草。人参被人们称为“百草之王”，是闻名遐迩的“东北三宝”(人参、貂皮、鹿茸)之一，是驰名中外、老幼皆知的名贵药材。人参的肉质根为强壮滋补药，适用于调整血压、恢复心脏功能、神经衰弱及身体虚弱等症，也有祛痰、健胃、利尿、兴奋等功效。人参的茎、叶、花，果以及加工副产品都是轻工业的原料，可加工出诸如含有人参成分的烟、酒、茶、晶、膏等商品。

由于该中药材价值珍贵，常常被不法分子假借其他原料来冒充，或者在人参中掺杂其它原料。为满足检验监管工作和相关部门打假执法的需要，希望提供一种准确、方便、灵敏、可定量的人参检测方法。

当前所用于人参的分子生物学检测方法较少，主要为常规PCR或荧光定量PCR，常规PCR检测繁琐不便，而荧光定量PCR所用的标准曲线又会对测量结果产生影响，因此上述方法均不能满足实际的检测需要。

而数字PCR作为核酸定量的新技术，本质上将一个传统的PCR反应分成了数万个PCR反应，在这数万个反应单元中分别独立扩增和检测目的序列，减少了背景序列及抑制物对PCR反应的干扰，从而大大提高了检测的灵敏度。其中ddPCR(微滴式数字PCR)更是无需依赖于Ct值和标准曲线就可以进行精确的定量检测，解决了荧光定量PCR所用的标准曲线对测量结果产生影响等问题。因此，本发明希望研发出一种能够更好用于检测人参的检测方法。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种定量检测人参的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法，能够对人参进行定量检测，并具有良好的特异性和灵敏性。

一种定量检测人参的微滴式数字PCR引物，包括用于扩增人参ITS(RS-ITS)基因的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列如下所示：

5’-AGTTGCGCCCGAAGCCATTA-3’(SEQ ID NO.1)，

5’-AGACACGGGAGGCCATTATC-3’(SEQ ID NO.2)。

本发明基于人参的ITS(内转录间隔区)序列进行特异性引物和探针的设计，经所述特异性引物扩增得到的片段长度为125bp。

一种定量检测人参的微滴式数字PCR探针，包括靶向人参ITS基因的特异性探针，所述特异性探针的核苷酸序列如下所示：

5’-ATCACTCCCTTGCGGGAGTTGA-3’(SEQ ID NO.3)。

优选的，所述探针标记有荧光基团和淬灭基团。

所述荧光基团优选为FAM、TET、HEX、CY3、JOE、VIC、ROX或CY5中的一种；所述淬灭基团优选为BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、MGB或Eclipse中的一种。

一种检测工具，包括上述检测人参的引物和/或上述检测人参的探针。