[发明专利]壳聚糖酶OUC-T613及其应用

说明书

本发明公开了壳聚糖酶突变体OUC‑T613，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码壳聚糖酶突变体OUC‑T613的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述壳聚糖酶OUC‑T613在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用。本发明的壳聚糖酶OUC‑T613，是通过DNA基因重组技术改造并筛选获得的，相比壳聚糖酶OUC‑CsnPa，催化活性提高了1.92倍，比酶活达到1576.36U/mg。酶解1h的转化率提高46％，相比野生型，达到完全转化的时间提前3h。是特异性制备部分paCOS的理想催化剂。利用本发明的壳聚糖酶OUC‑T613在催化活性和效率方面具有明显的优势。

技术领域

本发明涉及一种经DNA重组得到的壳聚糖酶突变体OUC-T613，及其在降解壳聚糖/制备壳寡糖中的应用，属于功能酶技术和基因工程领域。

背景技术

壳聚糖是β-(1,4)糖苷键联结的N-乙酰基-D-葡萄糖胺(GlcNAc，A)和D-葡萄糖胺(GlcN，D)单元的聚合物，它们是部分N-乙酰化的生物聚合物，可溶于酸性水性介质，被认为是功能最全，最有前途的功能性生物聚合物之一。壳聚糖的更生态，可持续和有效利用非常重要，而低成本且易于控制的酶水解是将大量生物质转化为寡聚降解产物的关键，寡聚降解产物的生物活性功能是壳聚糖的升华和延续，而壳聚糖具有特殊的结构和功能。部分乙酰壳寡糖(paCOS)被证明具有多种生物活性，例如改善食品质量，抗菌活性，抗肿瘤特性以及免疫调节作用，并且已经在食品，营养，制药，化妆品和农业等多种应用中得到应用，例如一种通过脱乙酰壳聚糖生产paCOS的有前途的工具是来自不同糖苷水解酶(GH)家族的壳聚糖酶(E.C.3.2.1.132)，其不仅可以在温和的条件下进行，而且可能产生大量的低聚物,同时对不同的乙酰底物有着不同的偏好性。因此，对paCOS的利用与壳聚糖酶的可利用数量有关。考虑到环境，经济和工业生产的需求，迫切需要一种用于有效地水解壳聚糖的更理想壳聚糖酶突变体，其具有出色的催化效率。基于现有壳聚糖酶的蛋白质工程策略为获得具有优异性能的候选基因提供了很好的选择。

蛋白质催化剂的定向进化，DNA改组，在表型改良方面取得了重大突破，模仿了同源重组的自然过程。通过结合多亲本的全部优势，它是有效而可靠地产生所需候选人的强大工具。此外，DNA改组提供了文库的序列多样化，并偶发地在不同点诱导突变，从而导致复杂的表型。此外，作为一种很有前途的技术，DNA改组与传统方法相比，具有更快的传播有益突变的速率，被广泛用于快速增加DNA文库的大小。DNA改组被证明在多种应用中非常有效。革兰氏阴性菌作为宿主的全细胞催化显示出筛选重组蛋白文库的巨大潜力，这使得筛选改良的突变体是可行的。因此，可以采用上述策略来增强壳聚糖酶的催化活性和酶促性质。

发明内容

针对上述现有技术，本发明通过DNA基因重组技术筛选，得到了一种壳聚糖酶突变体，其具有高催化活性，用该突变体催化制备paCOS，可弥补现有酶活力低，表达水平不高的不足。

本发明是通过以下技术方案实现的：

壳聚糖酶突变体OUC-T613，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MMLSGLSGPSPAKAFAEENGTTVQETVDLNEGDNSNEASTESLSLTNEEATSQAAVTATDHDANFSPSTLQFLKANTGLDGEQWDNIMKLVNKPEQDSLKWTEFYGYAEDIGDNRGYTIGIFGATTGGSNDTGPDGPDLFKAFDAASGASSPSIAGGLTRAGLKGKMSGSILKLSDSDSVIKKKIKALQNNEAWREAMWRTFYDTYIKYSVQQAQKRGFNTALTIGSFVDTALNQGATGDSGSLEGILSRSGSSTNEKTFMTNFYAKRTLIVDTNDYNQPPNGKNRVKQWSSLLASGETDLKNADAAVIKVTNWEMK。

一种编码上述壳聚糖酶突变体OUC-T613的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。