[发明专利]一种土壤DNA快速提取方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种高效提取土壤微生物DNA的方法，本试剂盒无需有机溶剂，使用胍盐和无机盐缓冲液DNA提取试剂盒相结合的方法，能够有效去除腐殖质，脂类和糖类物质对DNA提取的干扰，能适应于各种土壤类型，能够有效地富集DNA，并去除腐殖质的污染。DNA纯度和浓度检测实验结果证明本发明提取方法获得的DNA既能够达到下游实验的要求，也能有效的降低腐殖质的影响。

技术领域

本发明属于微生物学和分子生物学技术领域，具体涉及一种高效提取土壤微生物DNA的方法及试剂盒。

背景技术

由于土壤微环境的多样化，土壤微生物具有高度多样性。这些高度多样性的微生物及群落功能的研究不但可以了解生命如何耐受极端环境、新的生物能源、生命进化以及微生物与环境之间的相互作用，还可以用于人类疾病新型诊断，新型治疗等方法的开发。

研究土壤微生物多样性的有效手段是对土壤中的DNA进行分离纯化及分析，跟踪某些目标菌株或重组基因在自然环境中的行为；也可以用来揭示土壤微生物生态系统中的基因的多样性及其随环境的变化；还以从各种不同来源的土壤中抽提和纯化土壤微生物基因组DNA是非常关键的一步。

基因组DNA提取的主要目标是高纯度，高浓度并且能代表多种微生物DNA，从而从微生物群落中获得最具代表性的DNA，并进行下一步分析(如PCR、SSCP、宏观基因组测序、质谱分析等)。但是来自环境中的样品含有非常复杂的成分，尤其是土壤中的腐质酸类物质在提取过程中很难有效去除，腐殖质有类似于核酸的物理化学性质。因此，大部分腐殖质连同被吸附的有机分子一起与DNA共同分离。腐殖酸对后续的有生物酶参与的分析，比如PCR扩增、内切酶消化、高通量测序等有极大的抑制作用。在大多数宏基因组研究中，从各种来源的土壤样本中分离出不含腐殖质的高纯度宏基因组DNA，是很大的挑战。此外，细胞裂解后粗提DNA的每一个纯化步骤，例如在DNA分子研究之前进行的重复性纯化步骤，不可避免的引起了DNA的损失。大部分基因组DNA提取方法全都存在缺陷，例如细胞裂解不完全，DNA吸附于土壤表层，土壤提取物中含有酶抑制剂以及DNA的丢失、降解和剪切。因此，研究一种高效提取土壤微生物基因组DNA的试剂盒，对于大规模开展土壤微生物基因组学研究显得十分必要。

发明内容

为解决土壤微生物DNA提取纯化过程中，不同土壤样本中腐殖质难以去除以及DNA回收率低等问题，本发明提供了—种20分钟内从各种土壤样本中提取不含腐殖质、高纯度、高浓度微生物基因组DNA的方法及试剂盒。

为了实现上述发明目的，本发明提供一种从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物总DNA的方法，其包括如下步骤：

所述用于评价土壤微生物群落多样性的土壤DNA提取方法，包括以下步骤：

(1) 称取新鲜土壤0. 5-1g于2mL EP管中，加入200μL Pre-Wash溶液，在漩涡振荡器上振荡2min；

(2) 加入600μL土壤裂解液，涡旋震荡5 min至样本充分混匀；70℃孵育10 min，孵育期间震荡2-3次；

(3) 12,000 rpm离心3 min。取上清液至新的1.5ml离心管中；

(4) 将步骤(3)获得的上清液转移到新的EP管中，随后上清液加入100µL杂质沉淀剂，涡旋混匀后冰浴5min。12,000rpm离心3min；

(5) 将步骤(4) 获得的上清液转移500µL到新的EP管中，加入250µL DNA结合液和500µL 乙醇；

(6) 将步骤(5) 获得的上清混合液转移到DNA吸附硅胶柱，以12000rpm的转速离心1min，移除离心液并保留DNA吸附柱；

(7) DNA吸附柱重新放入收集管中，向DNA吸附柱中加入500μL蛋白杂质去除液，以12000rpm的转速离心2min，移除离心液并保留DNA吸附柱；

(8) 将DNA吸附柱重新放入收集管中，向DNA吸附柱中加入500μL蛋白杂质去除液，以12000rpm的转速离心2min，移除离心液并保留DNA吸附柱；