[发明专利]一种改善生态养殖优良海洋红酵母及其制备方法

权利要求书

1.一种改善生态养殖优良海洋红酵母的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，将海洋红酵母接种至各组份分别为：蔗糖4.0g、胰蛋白胨4.0g、酵母膏3.0g、MgSO₄ 0.2g，溶剂为海水100ml，pH为7.9-8.3，120℃下灭菌30min的30ml发酵培养基中，在28℃，150r／min条件下，摇床振荡培养1d，然后取10%培养液在6000rpm转速下离心10min去上清液，剩余菌体用灭菌海水洗涤2-3次后，将打散的细胞悬浮于10ml且pH为8.0的tris缓冲液中，得到细胞悬浮液；

步骤二，取10%细胞悬浮液转移至各组份分别为：蔗糖4.0g、胰蛋白胨4.0g、酵母膏3.0g、MgSO4 0.2g，溶剂为海水100ml，pH为7.9-8.3，120℃下灭菌30min且添加有5mg平阳霉素的10ml发酵培养基中，在28℃，150r／min条件下，进行摇床振荡诱变培养2d，得到初步诱变细胞培养液；

步骤三，取10µl初步诱变细胞培养液涂抹于玻璃片上，并在2mm的照射距离、12SLM的气体质量流量下，照射60s，对其进行等离子体诱变，将诱变后的细胞培养液转入40ml各组份分别为：葡萄糖3.0g、胰蛋白胨3.0g、酵母膏1.5g、琼脂粉2.0g，溶剂为海水100ml，pH为7.9-8.3，120℃下灭菌30min的YPD培养基中于28℃培养1d；

步骤四，在9000rpm转速下离心5min收集细胞，用灭菌海水洗涤2-3次后稀释至细胞浓度为10⁶~10⁷，涂抹在各组份分别为：葡萄糖3.0g、胰蛋白胨3.0g、酵母膏1.5g、琼脂粉2.0g，溶剂为海水100ml，pH为7.9-8.3，120℃下灭菌30min并添加有0.6mgNH₄Cl的YPD平板上在28℃下培养5-7d；

步骤五，挑取平板上生长良好的菌落，即其在平板上表现为颜色更橙或更红的菌落，将挑取的菌种系统命名为X-i，其中i指代任意自然数，并接种至各组份分别为：蔗糖4.0g、胰蛋白胨4.0g、酵母膏3.0g、MgSO4 0.2g，溶剂为海水100ml，pH为7.9-8.3，120℃下灭菌30min的250ml并添加有1.5mg NH₄Cl发酵培养基中，在28℃，150r／min条件下，摇床扩种培养5-7d；

步骤六，选出的目标海洋红酵母菌株X-7连续进行10代培养，等量接种至配制的氨氮浓度为6mg/L，pH为8.0的等体积海水养殖水体中摇床振荡培养2d，检测水体中的氨氮浓度，检测发酵培养基中NH₄⁺的含量及菌落OD600，挑选发酵培养基中NH₄⁺的检测浓度为0mg/L-1mg/L，OD600为0.8-1.0的海洋红酵母菌株，即为挑选出氨氮降解能力强且生长良好的海洋红酵母菌株；

步骤一中的海洋红酵母通过以下步骤的方法进行筛选：

步骤1.1，将从渔场海域中采集的表层海泥、海水样品加入到20mL各组份分别为：葡萄糖3.0g、胰蛋白胨3.0g、酵母膏1.5g、琼脂粉2.0g，溶剂为海水100ml，pH为7.9-8.3，120℃下灭菌30min的YPD 培养基中，于25℃振荡培养3d后，将培养液在YPD 固体培养基上划线；2d后再挑取平板上的疑似橙色或红色菌落单菌落进行在28℃，150r／min条件下摇瓶培养3d；接着再将培养液在含 0.05％氯霉素的YPD固体培养基上划线，进一步获得高纯度的单菌落；

步骤1.2，观察YPD培养基琼脂平板上菌落的色泽、质地，表面有否皱褶和边缘形状，在显微镜下观察菌体的形态特征；

步骤1.3，用 ITS 序列通用引物ITS1和ITS4进行 PCR 扩增；扩增程序为：95℃预变性10min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸10min；将PCR产物回收纯化并测序，运用Blast程序在GenBank数据库中进行同源序列搜索；根据同源序列搜索结果，下载相关菌种ITS 序列，与测序菌株的序列一同用ClustalX2.1软件进行多序列比对；最后采用MEGA7中的Neighbor—Joining法进行系统树的构建，并用Bootstrap对进化树进行1000次可信度分析；

步骤1.4，将获取的海洋红酵母分别接种至各组份分别为：蔗糖4.0g、胰蛋白胨4.0g、酵母膏3.0g、MgSO4 0.2g，溶剂为海水100ml，pH为7.9-8.3， 120℃下灭菌30min并添加0.2mgNH4Cl的100ml发酵培养基中，在28℃，150r／min条件下，摇床培养3-5d，检测发酵培养基中NH₄⁺的含量，挑选具有氨氮降解能力的海洋红酵母菌株。

2.一种改善生态养殖优良海洋红酵母，其特征在于，由权利要求1所述的方法制备得到。