[发明专利]一种高效制备霍乱弧菌菌影的方法

权利要求书

1.一种高效制备霍乱弧菌菌影的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、挑取霍乱弧菌工程菌株的单菌落，接种至种子培养基中，培养8～14h，获得霍乱弧菌种子液；所述霍乱弧菌工程菌株是含有目的质粒pBAD-sE的菌株，所述质粒pBAD-sE是将裂解蛋白E基因片段连接到pBAD-24质粒获得的重组质粒；

S2、将霍乱弧菌种子液接种至发酵培养基中，培养至菌液的吸光度值在600nm为4.5～5.5时，加入1.0～4.0 g/L阿拉伯糖进行诱导，溶氧水平控制在20～30％；

S3、在S2开始诱导培养1～3 h后，再次加入1.0～4.0 g/L阿拉伯糖进行二次诱导；

S4、在S2开始诱导培养3.5～4.5h检测到溶氧值下降至低于20%时，添加卡那霉素，继续培养0.5～1.5 h后活菌数目为0；

S5、在S2开始诱导培养4～6 h后结束发酵，菌影形成率达到99%以上；

步骤S2中，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖2.0～8.0 g/L、酵母粉2.0～10.0 g/L、蛋白胨1.0～5.0 g/L、柠檬酸1.0～2.0 g/L、KCl 1.0～3.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.0～3.0g/L、(NH4₎₂SO₄ 1.0～3.0 g/L、甜菜碱0.5～1.5 g/L、V_B1 15～25 mg/L、V_H 3～8 mg/L、氨苄霉素50～150 mg/L和氯化胆碱0.5～1.5 mL/L，其pH值为7 .30～7.50。

2.如权利要求1所述高效制备霍乱弧菌菌影的方法，其特征在于，在所述诱导培养的同时，按照1.0 mL/min的补加速率补加营养物质与抗生素，所述营养物质与抗生素包括：甘油5.0～8.0mL/L、酵母粉50～80g/L和氨苄霉素150～250mg/L。

3.如权利要求1所述高效制备霍乱弧菌菌影的方法，其特征在于，所述诱导阶段的pH值维持在7.30～7.50，溶氧水平控制在20～30％，温度控制在28～30℃。

4.如权利要求1所述高效制备霍乱弧菌菌影的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述霍乱弧菌种子液的接种量按5％～10％进行。

5.如权利要求1所述高效制备霍乱弧菌菌影的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述培养是在33～35℃、溶氧水平20～30％、pH值7.30～7.50的条件下，培养时间为5～8 h。

6.如权利要求1所述高效制备霍乱弧菌菌影的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述阿拉伯糖的加入量为2.0 g/L。

7.如权利要求1所述高效制备霍乱弧菌菌影的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述阿拉伯糖的再次加入量为2.0 g/L。

8.如权利要求1所述高效制备霍乱弧菌菌影的方法，其特征在于，在步骤S4中，所述卡那霉素的添加量为30 ～100 mg/L。

9.如权利要求1所述高效制备霍乱弧菌菌影的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、挑取霍乱弧菌工程菌株的单菌落，接种至种子培养基中，培养12h，获得霍乱弧菌种子液；

S2、将霍乱弧菌种子液按照5%接种量接种至发酵培养基中，培养至菌液的吸光度值在600nm为5.0左右时，加入2.0 g/L阿拉伯糖进行诱导；开始诱导后，pH维持在7.50，溶氧水平控制在20～30%，温度控制在30℃，同时以1.0 mL/min的补加速率补加一定营养物质与抗生素，所述营养物质与抗生素组成：甘油 5.0 mL/L、酵母粉50 g/L、氨苄霉素200 mg/L；

S3、在S2开始诱导培养2 h后，再次加入2.0 g/L阿拉伯糖进行二次诱导；

S4、在S2开始诱导4.1h时检测到溶氧值下降至低于20%，添加30 mg/L卡那霉素；

S5、在S2开始诱导培养5 h结束发酵，菌影形成率达到99%以上，活菌数目为0。