[发明专利]一种高效制备霍乱弧菌菌影的方法

说明书

本发明提供了一种高效制备霍乱弧菌菌影的方法，包括：在霍乱弧菌工程菌的培养过程中加入阿拉伯糖进行诱导，诱导培养1～3h后，再次加入阿拉伯糖进行二次诱导：在诱导阶段，当检测到溶氧值突然下降时，添加卡那霉素，继续培养0.5～1.5h后活菌数目为0；诱导培养4～6h后，菌影形成率达到99％以上。本发明利用二次诱导策略，缩短诱导时间，收获菌影量提高了16％以上，且内毒素含量降低至初始工艺的1/5以下，显著提高了生产效率，降低生产成本；本发明制备的霍乱弧菌菌影形态均匀、完整，活菌数目为0，无需再进行灭活处理，安全性更高。

技术领域

本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种高效制备霍乱弧菌菌影的方法。

背景技术

20世纪80年代奥地利学者Lubitz W等首先研发了一种新型疫苗——菌影疫苗(Vaccine of Bacterial Ghost)。细菌菌影(Bacterial Ghost，BG)是一种不含胞浆成分的完整细菌空壳，其基本原理是噬菌体PhiXl74的E蛋白能将革兰阴性菌裂解，裂解后的革兰阴性菌在细胞膜形成一个跨膜孔道结构，使菌内胞质内容物由孔道排出。这种灭活的细菌空壳作为疫苗使用其免疫原性要优于传统灭活疫苗。霍乱弧菌菌影(Vibrio CholeraeGhosts，VCG)可作为递呈系统，且VCG载体本身具有佐剂的性质，可产生很好的体液和细胞免疫应答。VCG在疫苗生产中的应用，不仅能够有效刺激机体的免疫应答，抵抗病原的感染，同时能够产生免疫记忆，抵抗病原的再次感染，同时具有无需佐剂、无致病性、安全性好、能够长时间稳定存在、可作为载体构建多价重组疫苗等优点。

在我们之前的研究(CN109355221B)中，通过培养基组分筛选、诱导时间确定、以及诱导条件优化等，实现了霍乱弧菌菌影的高密度发酵。但是，在该工艺中，诱导时间(菌影形成率达到99％以上时需要诱导11h)过长，降低了设备利用率，增加了工人工作时间。同时，较长的诱导时间，一方面导致部分菌影破碎，失去了完整的菌影结构，另一方面，由于菌影破碎导致较高的内毒素含量；部分菌影的破碎和内毒素的升高，均会影响霍乱弧菌菌影作为疫苗及疫苗佐剂的品质。另外，利用该工艺虽然菌影形成率可以达到99％以上，但是仍有少数丢失质粒的霍乱弧菌存在，极大地影响了霍乱弧菌菌影作为疫苗的安全性，进而需要进一步灭活处理，例如添加0.4％甲醛37℃灭活48h进行处理。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种高效制备霍乱弧菌菌影的方法，主要是制定了一种全新的菌影诱导培养及制备策略。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种高效制备霍乱弧菌菌影的方法，包括如下步骤：

S1、挑取霍乱弧菌工程菌株的单菌落，接种至种子培养基中，培养8～14h，获得霍乱弧菌种子液；

S2、将霍乱弧菌种子液接种至发酵培养基中，培养至菌液的吸光度值在600nm为4.5～5.5时，加入阿拉伯糖进行诱导；

S3、诱导培养1～3h后，再次加入阿拉伯糖进行二次诱导；

S4、在诱导阶段，当检测到溶氧值突然下降时(即“溶氧拐点”)，添加卡那霉素，继续培养0.5～1.5h后活菌数目为0；

S5、诱导培养4～6h后，菌影形成率达到99％以上。

进一步地，在所述诱导培养的同时，按照1.0mL/min的补加速率补加营养物质与抗生素，所述营养物质与抗生素包括：甘油5.0～8.0mL/L、酵母粉50～80g/L和氨苄霉素150～250mg/L。

优选地，所述营养物质与抗生素包括：甘油5.0mL/L、酵母粉50g/L、氨苄霉素200mg/L。

优选地，在步骤S2中，所述霍乱弧菌种子液的接种量按5％～10％进行。