[发明专利]一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法

权利要求书

1.一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，其特征在于，结合细胞模型和3D皮肤模型检测结果，对目标原料的抗炎活性进行筛选，包括以下步骤：

S1，评估原料样品的溶解性，确定溶解方案；

S2，RAW264.7小鼠巨噬细胞培养，3D皮肤培养；

S3，细胞及3D皮肤活性检测确定原料样品检测浓度，包括以下工序：

S31，取步骤S2中对数生长RAW264.7小鼠巨噬细胞接种培养16h～24h，加入实验样品，所述实验样品包含若干个不同浓度梯度原料样品，对照样品为不添加任何样品的培养基溶液，培养16h～24h，加入CCK-8或者MTT检测吸光度，计算细胞存活率；

S32，取步骤S2中生长状态稳定3D皮肤，加入实验样品，所述实验样品包含若干个不同浓度梯度原料样品，对照样品为不添加任何样品的缓冲液，培养24h～48h，用MTT检测3D皮肤组织存活率；

S33，步骤S31筛选得到RAW264.7巨噬细胞模型细胞存活率为90％时对应的原料样品给药浓度；

S34，步骤S32筛选得到3D皮肤组织存活率为90％时对应的原料样品3D皮肤模型给药浓度；

S4，取步骤S2中对数生长巨噬细胞接种培养18h，设置空白对照组，诱导对照组及样本组，其中，空白对照组及诱导对照组加入完全培养基，样品组加入由完全培养基配置的步骤S33中RAW264.7巨噬细胞模型细胞存活率为90％时对应给药浓度的原料样品，培养4h后，诱导对照组及样本组加入LPS，培养20h，分别检测细胞上清液分泌炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2和NO的含量；

S5，取步骤S2中生长状态稳定的3D皮肤，经SLS处理5min后，设置诱导对照组及样品组，诱导对照组加入缓冲液，样品组加入步骤S34中3D皮肤组织存活率为90％时对应给药浓度的原料样品，培养36h，分别检测培养液中炎症因子IL-1α、IL-8和PGE2含量；

S6，取步骤S2中生长状态稳定的3D皮肤，经UV处理3min～10min后，设置诱导对照组及样品组，诱导对照组加入缓冲液，样品组加入步骤S34中3D皮肤组织存活率为90％时对应给药浓度的原料样品，培养36h，分别检测培养液中炎症因子IL-1α、IL-8和PGE2含量；

S7，汇总步骤S4～S6中炎症因子含量测定结果，计算检测原料样品组分泌量与诱导对照组分泌量比值，得到炎症因子相对表达量，应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD；各组间比较采用One-way ANOVA统计分析；所有的统计分析均为双尾；

p0.05认为具有显著差异，用“*”表示，说明该原料样品具有一定抑制作用，评分为0.3；

p0.01认为具有非常显著差异，用“**”表示，说明该原料样品具有显著抑制作用，评分为0.7；

p0.001认为具有极其显著差异，用“***”表示，说明该原料样品具有极其显著抑制作用，评分为1.0；

根据上述评分标准汇总所有检测指标评分，由此筛选出最佳抗炎功效原料。

2.根据权利要求1所述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，其特征在于，所检测炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2和NO含量中至少一种构成细胞维度评价指标，所检测炎症因子IL-1α、IL-8和PGE2含量中至少一种构成3D皮肤维度评价指标。

3.根据权利要求1所述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，其特征在于，步骤S1中，水中溶解度≥1000μg/mL的原料样品直接溶于培养基进行后续实验；

水中溶解度＜1000μg/mL的原料样品用二甲基亚砜或乙醇溶剂溶解后进行后续实验。

4.根据权利要求3所述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，其特征在于，使用二甲基亚砜或乙醇作为溶剂时，溶剂的体积百分比浓度不得超过总体积的1％，且对照样品和实验样品中溶剂的体积比例相同。