[发明专利]一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法

说明书

本发明公开了一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，结合细胞模型和3D皮肤模型检测结果，对目标原料的抗炎活性进行筛选，包含两种维度的三种模型，使得化妆品原料作用对象涵盖了皮肤表皮层立体细胞结构到真皮层免疫细胞，构建化妆品原料的抗炎功效评价方法，属于系统型评估方法，具有快速、高效的优势；为皮肤护理产品抗炎活性原料的前期验证及筛选提供快捷可靠的评价方法，为抗炎原料的复配方案提供参考依据，也为护肤品行业动物替代实验、皮肤护理产品开发和功效验证的进一步研究提供有效依据。

技术领域

本发明涉及一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，属于化妆品原料性能测试技术领域。

背景技术

抗炎舒敏类功效性护肤品的开发中，其活性原料的抗炎功效评估是配方设计前期的重要步骤之一。传统活性原料抗炎功效评价手段主要依赖小鼠的耳肿胀实验，通常实验周期长，成本高，对于高通量原料筛选非常不方便。随着3R原则的循环经济理念推出，3R原则已经成为生物医药科学研究及相关法规管理普遍遵守的准则，欧洲化妆品法规也颁布了关于动物实验在化妆产品中的禁令，这些法规的变化促进了体外替代验证方法的开发及应用。构建体外替代功效验证方法有助于更为经济高效地实现抗炎舒敏类化妆品原料的开发和筛选。

炎症的发生通常伴随多种炎症因子的上调，巨噬细胞主要分布于人体真皮层中，是皮肤免疫应答过程的关键位点之一，内毒素诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞模型被广泛用于研究炎症反应，巨噬细胞在外部受到细菌毒素如脂多糖(LPS)等刺激时，可促使炎症介质如TNF-α、IL-6、PGE2、NO等的分泌。3D皮肤模型拥有与人正常皮肤相似的生理和结构，并且市售3D皮肤为统一化生产，结构特征较为稳定，利用3D皮肤模型进行抗炎活性物的检测，可以从化学诱导及物理诱导方法促使炎症因子IL-1α、IL-8和PGE2等的分泌，构建炎症模型，模拟真实皮肤的炎症受损状态，同时评估化妆品原料的抗炎舒敏功效。人体皮肤炎症的发生在皮肤表皮层及真皮层均能产生免疫应答，现有体外抗炎功效评估方法多为免疫细胞维度评估，而多数3D皮肤模型主要由角质细胞及成纤维细胞组成，通常缺乏免疫细胞，目前两种评估维度结合，综合评估化妆品原料抗炎功效的体外方法还未见相关专利和文献报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，包含两种维度的三种模型，使得化妆品原料作用对象涵盖了皮肤表皮层立体细胞结构到真皮层免疫细胞，构建化妆品原料的抗炎功效评价方法，属于系统型评估方法，具有快速、高效的优势。

实现上述目的的技术方案是：一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，结合细胞模型和3D皮肤模型检测结果，对目标原料的抗炎活性进行筛选，包括以下步骤：

S1，评估原料样品的溶解性，确定溶解方案；

S2，RAW264.7小鼠巨噬细胞培养，3D皮肤培养；

S3，细胞及3D皮肤活性检测确定原料样品最适浓度，包括以下工序：

S31，取步骤S2中对数生长巨噬细胞接种培养16h～24h，加入实验样品，所述实验样品包含若干个不同浓度梯度原料样品，对照样品为不添加任何样品的培养基溶液，培养16h～24h，加入CCK-8或者MTT检测吸光度，计算细胞存活率；

S32，取步骤S2中生长状态稳定3D皮肤，加入实验样品，所述实验样品包含若干个不同浓度梯度原料样品，对照样品为不添加任何样品的缓冲液，培养24h～48h，用MTT检测3D皮肤组织存活率；

S33，步骤S31筛选得到RAW264.7巨噬细胞模型细胞存活率为90％(CV90)时对应的原料样品给药浓度；

S34，步骤S32筛选得到3D皮肤组织存活率为90％(CV90)时对应的原料样品3D皮肤模型给药浓度；