[发明专利]一种L-天冬酰胺酶突变体及其在枯草芽孢杆菌中的表达

说明书

本发明公开了一种L‑天冬酰胺酶突变体及其在枯草芽孢杆菌中的表达，属于酶工程和微生物工程技术领域。采用本发明公开的米黑根毛霉来源的L‑天冬酰胺酶突变体A344E在45℃、pH7.0的条件下酶活为786.8U/mg，为野生酶509.1U/mg的1.5倍；并且本发明的L‑天冬酰胺酶突变体可以实现在枯草芽孢杆菌中高效表达，采用本发明提供的方法，可以得到是一种表达的L‑天冬酰胺酶突变体酶活为原始菌株7.1倍的重组枯草芽孢杆菌，拓宽其在食品领域的应用范围，使L‑天冬酰胺酶能大规模应用于生产中。

技术领域

本发明涉及一种L-天冬酰胺酶突变体及其在枯草芽孢杆菌中的表达，属于酶工程和微生物工程技术领域。

背景技术

L-天冬酰胺酶(L-asparaginase amidohydrolase，E.C.3.5.1.1)能够催化L-天冬酰胺水解生成L-天冬氨酸和氨，广泛存在于植物、动物和微生物中。细菌、酵母以及丝状真菌在内的许多微生物都是L-天冬酰胺酶的理想来源，由于微生物来源的L-天冬酰胺酶酶学性质优异、易于大规模生产、经济效益好等特点使其成为众多研究者的研究热点。

目前Escherichia.coli和Erwinia chrysanthemi是主要的L-天冬酰胺酶微生物制剂。在医药行业中，L-天冬酰胺酶可用于治疗急性淋巴细胞白血病，霍奇金淋巴瘤和淋巴系统恶性肿瘤等多种疾病。细胞在蛋白质合成的过程中需要L-天冬酰胺，正常的细胞由于自身具有L-天冬酰胺合酶，能合成满足自身生长所需的L-天冬酰胺。肿瘤细胞则没有L-天冬酰胺合酶，需要摄入外源L-天冬酰胺来维持自身生长。因此，通过注射L-天冬酰胺酶，降低肿瘤细胞外源L-天冬酰胺含量，能有效扼制肿瘤细胞，并且不影响正常细胞的生长。目前，来源于Aspergillus niger和A.oryzae的L-天冬酰胺酶已分别被帝斯曼公司和诺维信公司开发成商品和用于食品行业中。

然而，已在应用过程中的L-天冬酰胺酶缺陷也越来越受到人们的关注，无论是在医药行业还是食品行业中，由于作用环境的复杂性，需要酶在较广的pH和温度范围内保持高的底物转化率和酶活力。

现有报道的L-天冬酰胺酶中，其最适反应条件在温度和pH偏好性方面与商业化应用条件不匹配；因此，迫切需要获得具有高催化活性和稳定性好的L-天冬酰胺酶，并且能够实现其在枯草芽孢杆菌中高效表达，以满足大规模的工业生产的需求。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种酶活提高的可水解L-天冬酰胺的L-天冬酰胺酶(L-asparaginase amidohydrolase，E.C.3.5.1.1)且能在枯草芽孢杆菌中高效表达，并且能够实现在食品、药品、化妆品领域中大规模的工业化的应用。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种L-天冬酰胺酶突变体，所述L-天冬酰胺酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-天冬酰胺酶的第344位氨基酸进行突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述L-天冬酰胺酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-天冬酰胺酶突变体的第344位由丙氨酸突变成谷氨酸得到的，命名为A344E。

在本发明的一种实施方式中，编码所述L-天冬酰胺酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述L-天冬酰胺酶突变体A344E的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。