[发明专利]一种(S)-3-氰基-5-甲基己酸的制备方法

权利要求书

1.一种(S)-3-氰基-5-甲基己酸的制备方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：(1)生物转化：以含SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的腈水解酶基因的工程菌经发酵培养获得的菌体细胞为生物催化剂，以异丁基丁二腈为底物，以水为反应介质，在25-35℃、300-400rpm条件下进行转化反应，反应结束后，获得转化液；(2)分离提取：①将步骤(1)获得的转化液经离心或过滤，分离反应液和生物催化剂；②取上清液或滤液加入有机溶剂，搅拌萃取，静置分层，收集有机相和水相；③向水相中加入硅藻土，搅拌后抽滤，获得滤液和滤饼；④将滤液采用超滤膜过滤，得到超滤透过液；所述超滤膜孔径2.5-10KDa，膜通量为50-150mL/min；⑤将超滤透过液利用反渗透膜富集浓缩至原体积的1/6-1/3，得到(S)-3-氰基-5-甲基己酸浓缩液；所述反渗透膜孔径50-150Da。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述生物催化剂的加入浓度以反应介质体积计为1-10g/L；所述底物的加入浓度以反应介质体积计为100-500g/L。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤①离心条件为4℃、8000rpm离心10min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤②中有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚或甲苯中的一种。

5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于步骤②有机溶剂加入量为上清液或滤液体积的30-35％。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤③中硅藻土加入量以水相体积计为10-20g/L。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤④中超滤膜孔径5KDa，膜通量为76mL/min。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤⑤反渗透膜孔径为100Da。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述生物催化剂为重组腈水解酶工程菌经发酵培养获得的湿菌体，所述湿菌体按如下方法制备：

(1)斜面培养

将重组腈水解酶工程菌接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得菌体斜面；斜面培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂30g/L，溶剂为去离子水，pH值自然；

(2)种子培养

从菌体斜面挑取一环菌体接种至50mL含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养10h，获得种子液；

(3)发酵培养

将步骤(2)获得的种子液以体积浓度2％的接种量接种至LB液体培养基，37℃培养4h后，降温至28℃，添加终浓度10g/L乳糖进行诱导，诱导培养至OD₆₀₀至35，停止发酵，发酵过程中pH维持在7.0；发酵液于4℃、9000rpm离心10min，收集菌体细胞。