[发明专利]一种(S)-3-氰基-5-甲基己酸的制备方法

说明书

本发明公开了一种(S)‑3‑氰基‑5‑甲基己酸的制备方法，以腈水解酶为生物催化剂，以异丁基丁二腈为底物，以水为反应介质，在25‑35℃、300‑400rpm条件下进行转化反应，反应结束后，获得转化液；转化液经离心、萃取、硅藻土处理、超滤和反渗透，获得(S)‑3‑氰基‑5‑甲基己酸浓缩液。本发明方法提取收率达到95％以上。利用该方法提取的(S)‑3‑氰基‑5‑甲基己酸直接用于加氢反应，加氢收率大于80％，远高于目前专利报道的加氢收率。本发明简便易操作，可应用于工业化合成普瑞巴林。

(一)技术领域

本发明涉及一种(S)-3-氰基-5-甲基己酸的制备方法，特别涉及利用含重组腈水解酶工程菌生物转化制备以及提取(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法。

(二)背景技术

普瑞巴林(Pregabalin)化学名为(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸，是一种γ-氨基丁酸(GABA)的结构类似物，能有效阻断电压依赖性钙通道，减少神经递质的释放，具有良好的抗焦虑和治疗神经病理性疼痛效果。普瑞巴林上市以来，凭借显著的临床疗效和广泛的适应症，成为全球畅销药市场的“重磅炸弹”之一。

(S)-3-氰基-5-甲基己酸是普瑞巴林的关键手性中间体，进一步催化加氢即可获得普瑞巴林。以腈水解酶为生物催化剂，区域、立体选择性水解外消旋异丁基丁二腈是合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸最高效的方法之一，具有反应条件温和、原子利用率高、“三废”排放少等显著优势(CN201810136409)。专利CN1942587B报道了(S)-3-氰基-5-甲基己酸提取过程：首先用磷酸将酶催化反应液pH调节至2.1，用甲基叔丁基醚(MTBE)等有机溶剂萃取(S)-3-氰基-5-甲基己酸后，再将有机相在真空条件下浓缩后，加入KOH水溶液。进一步，将所得溶液在真空下浓缩获得(S)-3-氰基-5-甲基己酸钾盐，后者通过Raney镍加氢即可制备普瑞巴林。由于(S)-3-氰基-5-甲基己酸在酸性条件下极易分解生成其它副产物(OrganicProcess ResearchDevelopment,1997,1:26-38；Process Biochemistry,2020,89:186-192)，导致目前报道的方法提取与加氢收率低，仅为27％左右。因此，亟需开发高效的(S)-3-氰基-5-甲基己酸制备工艺。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种(S)-3-氰基-5-甲基己酸的制备方法，可以快速、有效地将生物转化液中的蛋白质等杂质去除，并且具有较高收率，便于其进行下一步加氢反应制备普瑞巴林。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种(S)-3-氰基-5-甲基己酸的制备方法，所述方法按如下步骤进行：(1)生物转化：以腈水解酶为生物催化剂，以异丁基丁二腈为底物，以水为反应介质，在25-35℃、300-400rpm(优选30℃、350rpm)条件下进行转化反应，反应结束后，获得转化液；(2)分离提取：①将步骤(1)获得的转化液经离心或过滤，分离反应液和生物催化剂；②取上清液或滤液加入有机溶剂，搅拌萃取，静置分层，未反应的底物被萃取收集到有机相中，收集有机相和水相；③向水相中加入硅藻土，搅拌后抽滤，获得滤液和滤饼；④将滤液采用超滤膜过滤，得到超滤透过液；所述超滤膜孔径2.5-10KDa，膜通量为50-150mL/min；⑤将超滤透过液利用反渗透膜富集浓缩至原体积的1/6-1/3，得到(S)-3-氰基-5-甲基己酸浓缩液，可以直接用于后续加氢反应；所述反渗透膜孔径50-150Da。

本发明所述生物催化剂可以是含腈水解酶的全细胞、含腈水解酶的细胞破碎液、固定化腈水解酶或纯化的腈水解酶。优选为含腈水解酶的全细胞，所述含腈水解酶的全细胞是以SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的腈水解酶基因的工程菌经发酵培养获得的菌体细胞。

进一步，步骤(1)所述生物催化剂的加入浓度以反应介质体积计为1-10g/L，优选含腈水解酶的全细胞干重计为1.25g/L；所述底物的加入浓度以反应介质体积计为100-500g/L，优选100-175g/L。