[发明专利]一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法

权利要求书

1.一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤A：进行hUC-MSCs的分离，在超净台内将脐带用无菌生理盐水冲洗干净，剪成小于1mm³的组织块碎后放入离心管中，将组织块平铺于10个T75培养瓶底部，加入含无血清培养基，置于37℃、含5%二氧化碳饱和湿度的恒温培养箱中，对hUC-MSCs进行分离；

步骤B：hUC-MSCs的体外扩增，细胞镜下观察生长且密度达70-80%时，开始进行传代操作，轻轻拍打培养瓶侧壁，使组织块完全脱落下来，将含有组织块的培养上清液弃掉，用PBS冲洗培养瓶底部，PBS清洗2次，加入1mL预热的0.05%胰酶，待显微镜下细胞变圆后，用旧培养液终止消化，轻轻吹打，吸取细胞悬液于离心管中，1500rpm/min，4℃离心5min，收集细胞，并计数，以5×10³/cm²的接种密度进行传代；

步骤C：收集P3代细胞进行降温冻存，将收集的细胞用程序降温仪进行降温冻存，并根据冷冻液浓度不同将其分为五组；

步骤D：hUC-MSCs复苏后与新鲜细胞进行比较统计，冻存10个月后将细胞置于37℃恒温水浴箱中快速复苏，融化后迅速移入离心管中，加入无血清培养基进行复苏，吹吸混匀，离心弃去上清液后用台盼蓝溶液计数计算活率；

步骤E：hUC-MSCs的检测及鉴定，五组hUC-MSCs复苏后进行培养，并对各组复苏后进行形态学观察。

2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法，其特征在于：所述步骤A中，在初次培养时，6天后培养液全量换液一次，镜下观察是否有细胞从组织块周围爬出，以后每3天换液一次，直至可见细胞爬出且密度达70-80%,可以考虑进行传代操作。

3.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法，其特征在于：所述步骤C和D中，细胞冷冻保存时，细胞降温、复温过程中必须经过-15℃～-60℃这一温度区间，而该温度区间对细胞具有一定的伤害性，选择程序降温仪进行程序降温。

4.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法，其特征在于：所述步骤C中，根据冻存液不同分为五组，DMSO:FBS=1：9、DMSO:FBS:DMEM=1：8.5：0.5，DMSO:FBS:DMEM=1：8：1、DMSO:FBS:DMEM=1：7：2，收集P3代细胞进行程序降温冻存。

5.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法，其特征在于：所述步骤E中，用MTT法比较细胞生长情况，加入无血清培养基进行培养，取复苏后对数生长期细胞，消化成细胞悬液，以P3代未冻存细胞悬液为对照组，调整细胞密度，按每孔1*10^4接种96孔板，去除培养基，加入20微升MTT溶液，采用酶标仪分别测定5组及对照组细胞的吸光度，流式细胞仪检测细胞周期，流式细胞仪检测细胞表面CD29、CD34、CD44、CD45、CD90 及CD105抗原。