[发明专利]一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法

说明书

本发明公开了一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法，包括进行hUC‑MSCs的分离、hUC‑MSCs的体外扩增、收集P3代细胞进行降温冻存、hUC‑MSCs复苏后与新鲜细胞进行比较统计和hUC‑MSCs的检测及鉴定。本发明的有益效果是：使用无血清培养贴壁法获得大量且纯度较高的MSCs，使用程序降温仪进行程序降温，降低对细胞的伤害，且保持较好的细胞活力，且得出冻存液比例为DMSO:FBS:DMEM=1:8.5:0.5时，冻存后活率最佳，复苏后形态及生长速率与正常新鲜细胞培养基本一致。

技术领域

本发明涉及一种细胞活性研究方法，具体为一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法，属于医学技术领域。

背景技术

间充质干细胞， MSC是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，人脐带间充质干细胞已成为细胞治疗的重要候选种子细胞,特别在各种退行性疾病和自身免疫性疾病的组织修复和免疫调节方面有良好的应用前景。

但过度传代会表现明显衰老或凋亡，且长期体外培养易发生自发分化，失去多分化潜能，增殖、黏附能力下降，细胞凋亡率增加，而且临床上细胞移植的供体和受体往往存在不同时性，很难保证即离即用，且充足的数量需求保证也会是一个问题，因此，本申请提出一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种间充质干细胞冻存液及其活性研究方法，包括以下步骤：

步骤A：进行hUC-MSCs的分离，在超净台内将脐带用无菌生理盐水冲洗干净，剪成小于1mm³的组织块碎后放入离心管中，将组织块平铺于10个T75培养瓶底部，加入含无血清培养基，置于37℃、含5%二氧化碳饱和湿度的恒温培养箱中，对hUC-MSCs进行分离；

步骤B：hUC-MSCs的体外扩增，细胞镜下观察生长且密度达70-80%时，开始进行传代操作，轻轻拍打培养瓶侧壁，使组织块完全脱落下来，将含有组织块的培养上清液弃掉，用PBS冲洗培养瓶底部，PBS清洗2次，加入1mL预热的0.05%胰酶，待显微镜下细胞变圆后，用旧培养液终止消化，轻轻吹打，吸取细胞悬液于离心管中，1500rpm/min，4℃离心5min，收集细胞，并计数，以5×10³/cm²的接种密度进行传代；

步骤C：收集P3代细胞进行降温冻存，将收集的细胞用程序降温仪进行降温冻存，并根据冷冻液浓度不同将其分为五组；

步骤D：hUC-MSCs复苏后与新鲜细胞进行比较统计，冻存10个月后将细胞置于37℃恒温水浴箱中快速复苏，融化后迅速移入离心管中，加入无血清培养基进行复苏，吹吸混匀，离心弃去上清液后用台盼蓝溶液计数计算活率；

步骤E：hUC-MSCs的检测及鉴定，五组hUC-MSCs复苏后进行培养，并对各组复苏后进行形态学观察。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤A中，在初次培养时，6天后培养液全量换液一次，镜下观察是否有细胞从组织块周围爬出，以后每3天换液一次，直至可见细胞爬出且密度达70-80%,可以考虑进行传代操作。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤C和D中，细胞冷冻保存时，细胞降温、复温过程中必须经过-15℃～-60℃这一温度区间，而该温度区间对细胞具有一定的伤害性，选择程序降温仪进行程序降温。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤C中，根据冻存液不同分为五组，DMSO:FBS=1：9、DMSO:FBS:DMEM=1：8.5：0.5，DMSO:FBS:DMEM=1：8：1、DMSO:FBS:DMEM=1：7：2，收集P3代细胞进行程序降温冻存。