[发明专利]一种利用玉米芯同步糖化发酵生产D-1,2,4-丁三醇的方法

说明书

本发明提供了一种利用玉米芯同步糖化发酵生产D‑1,2,4‑丁三醇的方法，该方法通过构建克隆表达2‑酮酸脱羧酶和D‑木糖脱氢酶，木糖酸脱水酶和醇脱氢酶的基因，并将构建好的基因转入宿主菌的细胞内得重组大肠杆菌，培养重组大肠杆菌并接种至含有经预处理过的玉米芯的培养基中发酵生产D‑1,2,4‑丁三醇。本发明以玉米芯为原料，同步糖化发酵生产丁三醇，D‑1,2,4‑丁三醇产量为6.44g/L。利用玉米芯同步糖化发酵生产1,2,4‑丁三醇，操作简便，产量较高，适合产业化生产。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用玉米芯同步糖化发酵生产D-1,2,4-丁三醇的方法。

背景技术

D-1,2,4-丁三醇是一种无色无味、透明、粘稠的四碳多元醇；在水和醇类物质中溶解度较高，具有吸湿性。在军事上，D-1,2,4-丁三醇可以用来合成作为火箭推进剂的丁三醇三硝酸酯(BTTN)，在医药方面，D-1,2,4-丁三醇可以作为缓释剂，制备抗病毒化合物的中间体，D-1,2,4-丁三醇也可以作为高分子材料的交联剂，增加材料的强度和硬度。

目前，D-1,2,4-丁三醇的生产主要集中于化学合成，即利用 NaBH₄还原苹果酸及其衍生物。但化学合成D-1,2,4-丁三醇反应需在2900-5000psi的H₂压力下和60-160ºC的条件下，反应条件十分苛刻，操作存在安全威胁，且环境污染严重。因此，继续开发能用于商业化生产D-1,2,4-丁三醇的方法。

生物法合成D-1,2,4-丁三醇由于安全可靠，来源易得等优点，目前备受瞩目。生物法合成D-1,2,4-丁三醇主要以木糖为底物，经过D-木糖脱氢酶，木糖酸脱水酶、2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶四步酶反应合成。目前生物法合成D-1,2,4-丁三醇主要涉及两种方法：一种是大量培养表达上述四种酶的微生物，培养结束后收集细胞，利用收集的细胞将木糖转化为D-1,2,4-丁三醇，即全细胞催化法；这种方法具有转化率较高的优势，但过程中步骤繁琐，不利于大规模生产；另一种是在培养表达上述四种酶的微生物的过程中，加入底物木糖，直接生产BT。利用微生物直接发酵生产BT成本低廉，过程中操作简便，有利于大规模生产。

玉米芯是一种常见的农业废弃物，其主要成分有纤维素，半纤维素，木质素等，其中，半纤维素为木聚糖型，经过半纤维素酶处理，即可转化为木糖，玉米芯的应用价值和经济潜力都是十分巨大的。利用玉米芯为原料通过微生物发酵转化为目标产物可以有两种途径：分步糖化发酵和同步糖化发酵。分步糖化发酵先将玉米芯糖化，后使用含有单糖的水解液进行发酵。CN106148429B公开了一种生物转化纤维素水解液生产D-1,2,4-丁三醇的方法。该方法为构建克隆表达2-酮酸脱羧酶和D-木糖脱氢酶，木糖酸脱水酶和醇脱氢酶的基因，并将构建好的基因转入敲除木糖异构酶的宿主菌的细胞内得基因工程菌，培养基因工程菌并接种至纤维素水解液中发酵生产D-1,2,4-丁三醇。该方法采用稀酸预处理玉米芯得到含有木糖的水解液，稀酸预处理过程会产生糠醛等对菌株生长不利的发酵抑制剂，且水解液pH很低，需要预先经过氢氧化钙中和硫酸，活性炭脱毒等步骤才能应用到发酵过程中。步骤较多，不利于大批量发酵。同步糖化发酵将酶解过程与发酵过程耦合，玉米芯酶解与菌株发酵同步进行，构成同步糖化发酵过程，操作简便，生产成本低廉，有较大的商业化生产空间。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用玉米芯同步糖化发酵生产D-1,2,4-丁三醇的方法，降低了生产成本的同时，提高了1,2,4-丁三醇的产量,本发明使用碱预处理玉米芯，使玉米芯易于酶解，使用处理后的玉米芯残渣作为底物，除水洗残渣外无需中和、脱毒等步骤，节省成本，操作更加简便，且产量有进一步提升。

为解决现有技术问题，本发明采用的技术方案：

一种利用玉米芯同步糖化发酵生产D-1,2,4-丁三醇的方法，通过构建克隆表达2-酮酸脱羧酶和D-木糖脱氢酶，木糖酸脱水酶和醇脱氢酶的基因，并将构建好的基因转入宿主菌的细胞内得重组大肠杆菌，培养重组大肠杆菌并接种至含有经预处理过的玉米芯的培养基中发酵生产D-1,2,4-丁三醇。