[发明专利]三维培养血管内皮细胞的方法

说明书

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种高效三维培养血管内皮细胞的方法。针对现有贴壁生长细胞3D微组织培养的耗材贵，形成微组织球体时间较长、效率低等问题，本发明提供了一种高效三维培养血管内皮细胞的方法，包括以下步骤：a,配制甲基纤维素培养基；b,接种内皮细胞到低粘附平面形成悬滴；c,18‑24小时后收集内皮细胞微组织球体；d，内皮细胞微组织球体进行出芽实验检测其血管新生能力。本方法所使用的甲基纤维素培养基和低粘附平面均采用实验室常用试剂耗材制备，无需专门购买，可得性强，成本较低，且微组织球体形成时间明显缩短，提高实验效率，适于后续内皮细胞微组织球体功能检测及药物筛选。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种高效三维培养血管内皮细胞的方法。

背景技术

血管内皮细胞在标准二维培养体系中会丢失许多分化完成后的表型特征，这对在体外培养条件下研究分化完成后的内皮细胞功能产生了限制。三维细胞培养体系为内皮细胞提供了更加接近体内生存条件的微环境，能够更好的模拟生理状态，从而能够获得与体内实验更加一致的实验结果。

目前三维细胞培养技术中应用最广阔的是无支架培养体系，其可通过悬滴让细胞在重力的作用下通过自组装形成微球体。该体系形成的微组织球体具有高一致性，可为后续研究提供好的微组织材料。

专利CN108060132A公开了一种基于肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞的3D共培养模型，该方法采用的3D培养基成分为含有0.24％的甲基纤维素的细胞培养基，然后将含有2500个细胞的100μl 3D细胞培养基加入未经过组织处理的96孔圆底板，3天后形成微组织球体。该方法仍需专门购买商业化的未经过组织处理的圆底培养板，且细胞接种到上述培养装置后形成微组织球体时间较长(3天)，影响实验效率。另外，由于该培养装置的培养孔数目固定，通常为96孔，如果实验中仅需使用少量微组织球体，容易造成浪费。

专利CN111334469A和CN111334470A公开了一种外周血单个核细胞体外3D甲基纤维素琼脂糖水凝胶培养基及其制备方法，该方法需要配制数种不同浓度甲基纤维素和琼脂糖溶液，且由于琼脂糖溶液在最终形成水凝胶之前均需控制温度以避免凝固，否则将无法进行后续操作，操作过程繁琐。且该方法本身用于非贴壁细胞的培养，未能提供其在贴壁细胞三维培养中的微组织球体形成所需时间及效果。因此，该方法无法为贴壁细胞三维培养形成微组织球体提供启示。

目前，仅有商业化的悬滴板可以用来进行细胞的3D微组织培养，该商业化的悬滴板必须要经过特别的处理，才能避免细胞贴壁生长，从而形成微球体。但是，商业化的悬滴板购买不易，仅有少数几家国外的耗材公司提供，价格昂贵，且培养孔数目固定，不易根据所需微组织数量调整耗材用量，灵活性较低。

因此，如何采用普通的实验装置实现血管内皮细胞的无支架培养成为了行业内亟待解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：现有贴壁生长细胞3D微组织培养的耗材贵，形成微组织球体时间较长、效率低等问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种高效三维培养血管内皮细胞的方法。该方法包括以下步骤：

a、配制含有浓度为0.5％～2％的甲基纤维素的DMEM培养基；

b、将62500～375000个血管内皮细胞重悬在终体积为4ml含20％ FBS的高糖DMEM完全培养基中，加入1ml步骤a的培养基，混合均匀，制备得到单细胞悬液；

c、取40μl步骤b的单细胞悬液，接种至低粘附平面，将平面翻转后，形成悬滴，将悬滴在温度37℃、CO₂浓度5％的条件下进行培养，得到血管内皮细胞的微组织球体。

其中，上述高效三维培养血管内皮细胞的方法中，步骤a中所述的甲基纤维素粘稠度为4000cp。