[发明专利]一种sgRNA文库构建方法

权利要求书

1.一种sgRNA文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步、sgRNA设计；

第二步、上下游引物合成；

第三步、构建sgRNA文库。

2.根据权利要求1所述的一种sgRNA文库构建方法，其特征在于，sgRNA设计具体操作为针对需编辑的基因设计sgRNA，每个基因通常设计3条sgRNA，每条sgRNA 20bp，20个碱基作为靶基因的特异性识别序列。

3.根据权利要求1所述的一种sgRNA文库构建方法，其特征在于，上下游引物合成具体步骤为上游引物50-80bp，从5’端至3’端依次为与载体的5’端20-40bp同源序列，20bpsgRNA，15-20b与下游引物3’端互补序列；下游引物为通用引物，35-60bp，从5’端至3’端依次为与载体的5’端20-40bp同源序列，15-20b与上游引物3’端互补序列。

4.根据权利要求1所述的一种sgRNA文库构建方法，其特征在于，构建sgRNA文库具体步骤如下：

首先将第二步中N条上游引物等量混合均匀，再与下游引物一起混合均匀，最终浓度为10μm；将其作为PCR扩增的引物和模板，添加dNTP、PCR反应Buffer、高保真DNA聚合酶等，反应体系为10-100uL，进行PCR扩增；PCR产物的大小在60-140bp之间，采用乙醇/异丙醇沉淀的方式回收pcr产物；

其次以BsmBI酶切商品化质粒lentiCRISPR v2，并与纯化后的pcr产物通过Gibson重组的方式进行连接；转化至感受态细胞后37℃下过夜培养，对慢病毒载体lentiCRISPR v2优选重组酶recA13突变型菌株Stbl 3，为提高转化效率，宜选择电转感受态；

然后挑选单克隆，摇菌抽质粒，测序验证；

最后对测序结果进行分析统计。