[发明专利]一种sgRNA文库构建方法

说明书

本发明公开了一种sgRNA文库构建方法，包括以下步骤：第一步、sgRNA设计；第二步、上下游引物合成；第三步、构建sgRNA文库；所述的sgRNA由PCR扩增得到，涉及n条特异性引物Fn1，Fn2，Fn3，—Fnn，一条通用引物R；其中，特异性引物Fn1与载体5’端有20‑50bp同源，通用引物R与载体3’端有20‑50bp同源，且二者之间有15‑50bp的同源，与传统的退火连接方法相比，本发明通过PCR的方法得到混合sgRNA库，大大节省引物合成成本，提高合成产量。本发明提供了一种高通量、高效率的sgRNA基因文库构建方法。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体的，涉及一种sgRNA文库构建方法。

背景技术

基于CRISPR-Cas系统的靶向基因组编辑技术是研究生物学和基因治疗的强 大工具，能够完成RNA导向的靶基因识别及编辑(敲除、插入、突变)。CRISPR-Cas 系统最初发现于细菌体内，CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)与Cas蛋白一起实现针对外源基因的免疫防御。CRISPR 是细菌内一段小段规律成簇间隔短回文序列，CRISPR-Cas9基因编辑系统主要由 Cas9和sgRNA组成，Cas9是与CRISPR序列相关的核酸内切酶，sgRNA为一段序 列特异性向导RNA分子(sequence-specific guide RNA)，可引导Cas9到达靶 基因处，从而完成基因组的编辑。

除了多克隆筛选方法外，CRISPR-Cas可用于快速高效地生成大量的敲除细 胞，针对全基因组sgRNA的基因文库做大规模的功能基因筛选，如利用人源细 胞的慢病毒敲除sgRNA文库，筛选出疽热毒素(chimaeric anthrax，PA/LFnDTA) 和白喉毒素(diphtheriatoxin，DT)引起致病性的相关基因，这种基因筛选技 术不仅能用于探索致病机制，还能应用于基因治疗等相关领域。

发明内容

本发明的目的在于提供一种一种sgRNA文库构建方法。

本发明需要解决的技术问题为：

现有技术中，sgRNA为一段序列特异性向导RNA分子，可引导Cas9到达靶基 因处，从而完成基因组的编辑，针对全基因组sgRNA的基因文库做大规模的功能 基因筛选，筛选出疽热毒素和白喉毒素引起致病性的相关基因，这种基因筛选 技术不仅能用于探索致病机制，还能应用于基因治疗等相关领域。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种sgRNA文库构建方法，包括以下步骤：

第一步、sgRNA设计：针对需编辑的基因设计sgRNA，每个基因通常设计3条 sgRNA，每条sgRNA 20bp，20个碱基作为靶基因的特异性识别序列；

第二步、上下游引物合成：上游引物50-80bp，从5’端至3’端依次为与载 体的5’端20-40bp同源序列，20bp sgRNA，15-20b与下游引物3’端互补序列； 下游引物为通用引物，35-60bp，从5’端至3’端依次为与载体的5’端20-40bp 同源序列，15-20b与上游引物3’端互补序列；

第三步、构建sgRNA文库：(1)将第二步中N条上游引物等量混合均匀，再 与下游引物一起混合均匀，最终浓度为10μm；将其作为PCR扩增的引物和模板， 添加dNTP、PCR反应Buffer、高保真DNA聚合酶等，反应体系为10-100uL，进行 PCR扩增；PCR产物的大小在60-140bp之间，采用乙醇/异丙醇沉淀的方式回收pcr 产物；(2)以BsmBI酶切商品化质粒lentiCRISPR v2，并与纯化后的pcr产物通 过Gibson重组的方式进行连接；转化至感受态细胞后37℃下过夜培养，对慢病 毒载体lentiCRISPR v2优选重组酶recA13突变型菌株Stbl3，为提高转化效率， 宜选择电转感受态；(3)挑选单克隆，摇菌抽质粒，测序验证；(4)对测序 结果进行分析统计。