[发明专利]一种高纯度CRISPR-Cas9蛋白的酶切方法

权利要求书

1.一种高纯度CRISPR-Cas9蛋白的酶切方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步、载体构建：合成RGP基因，并克隆至自行改造pGreat-M载体，完成载体构建，进行条件优化，筛选最优单克隆；

第二步、载体蛋白表达和纯化：使用组合形纯化标签His+MBP+TEV+Cas9进行载体蛋白表达和多步纯化条件优化；

第三步、高浓度和纯度纯化方案设计：即使用自行优化的培养基培养，MBP柱进行纯化，His-TEV酶进行酶切，再通过Ni柱反筛，分子筛和离子柱多步纯化，获得高纯度和浓度的Cas9蛋白，并进行HPLC检测；

第四步、基因敲除酶切体系条件构建和效率优化：包括SSA活性检测、体外切割活性验证、内源活性检测。

2.根据权利要求1所述的一种高纯度CRISPR-Cas9蛋白的酶切方法，其特征在于，所述载体构建的具体步骤如下：首先合成RGP基因，并克隆至自行改造pGreat-M载体，得到重组质粒，然后将重组质粒分别加入至100μL的感受态细胞中，轻轻混合均匀，置于冰上25min，再于42℃水浴条件下，热激95s后立即转移至冰上放置5min，得第一混合物，向第一混合物中加入600μL的预热LB培养基，所述预热LB培养基为37℃水浴下放置5min后的LB培养基，然后于37℃下振荡培养1h，取出500μL培养的菌体，用涂布棒将其均匀涂在含有相应抗性的LB琼脂平板中，于温度为37℃下，倒置培养过夜，得到最优单克隆，选取单克隆于5管LB培养基中，在温度37℃下，培养至菌体OD600为0.6-0.8，然后加入浓度为1mol/L的IPTG至其最终浓度为0.5mM，培养4h后，在转速13000r/min条件下，离心，然后收集菌种制样，进行SDS-PAGE与Western Blot分析；将接种保种菌培养至菌体OD600为0.6-0.8，取4管培养物并向其中加入浓度为1mol/L的IPTG至终浓度分别为0.2mM、0.2mM、1mM与1mM，将IPTG终浓度0.2mM、1mM的一组样品于37℃下，转速220r/min条件下，培养4h，另一组于15℃，转速220r/min条件下，培养16h，诱导融合蛋白表达，然后各条件制样，进行SDS-PAGE分析；取IPTG终浓度0.2mM、1mM、于37℃下、转速220r/min条件下、培养4h和于15℃、转速220r/min条件下、培养16h的菌液进行离心收集菌体，利用Tris-NaCl buffer进行细胞破碎，然后将上清沉淀分别制样，进行SDS-PAGE分析。

3.根据权利要求1所述的一种高纯度CRISPR-Cas9蛋白的酶切方法，其特征在于，所述载体蛋白表达和纯化的具体步骤如下：取菌液50μl接种于100mL含卡那霉素的LB液态培养基中，于温度37℃，转速220r/min条件下过夜培养，次日将菌液全部移至1L含卡那霉素的LB液态培养基培养至菌液OD600＝0.6-0.8时向其中计入诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导4h后收集菌体，弃上清，按每毫升菌体5-10mL咪唑平衡缓冲液的比例悬浮菌体，进行超声波破碎，所述咪唑平衡缓冲液的浓度为10mmol/L，pH值为8.0，所述超声波破碎每次4s、间隔6s、破碎15-20min，破碎后于4℃，转速12000r/min条件下，离心30min，然后取上清，再用0.45μm孔径的滤膜过滤上清，利用His-Tag技术进行纯化，首先根据待纯化蛋白的量将介质加入层析柱中，静置5min待液体流尽，然后再取5-10倍柱体积的10mmol/L、pH8.0的咪唑平衡缓冲液于层析柱中，静置5min待液体流尽，然后将样品少量多次加入层析柱中，静置3min左右再流出，收集流出液，少量多次加入5-10倍柱体积的10mmol/L、pH8.0的咪唑平衡缓冲液洗涤蛋白，再依次用10mmol/L、20mmol/L、50mmol/L的pH8.0咪唑平衡缓冲液洗脱5个柱体积，静置30min，收集流出液并进行SDS-PAGE电泳检测纯化效果。

4.根据权利要求1所述的一种高纯度CRISPR-Cas9蛋白的酶切方法，其特征在于，所述HPLC纯度检测的具体步骤如下：使用HPLC结束检测目的蛋白纯度，用蛋白质标样配制三组不同浓度的蛋白质溶液，接着绘制蛋白质浓度与峰高和峰面积相关的标准曲线，再在相同条件下测位置样品的峰高和峰面积，即可得未知样品的浓度，保证待测样品中所有组份均出峰的情况下，用目标蛋白的峰面积和峰高除以所有峰峰面积和峰高的总和即可的目标蛋白的纯度。