[发明专利]一种高纯度CRISPR-Cas9蛋白的酶切方法

说明书

本发明公开了一种高纯度CRISPR‑Cas9蛋白的酶切方法，第一步、载体构建：合成RGP基因，并克隆至自行改造pGreat‑M载体，完成载体构建；第二步、载体蛋白表达和纯化：使用组合形纯化标签His+MBP+TEV+Cas9进行载体蛋白表达和多步纯化条件优化；第三步、高浓度和纯度纯化方案设计：使用自行优化的培养基培养，MBP柱进行纯化，His‑TEV酶进行酶切，通过Ni柱反筛，分子筛和离子柱多步纯化，并进行HPLC检测；第四步、基因敲除酶切体系条件构建和效率优化：包括SSA活性检测、体外切割活性验证、内源活性检测，本研究保证了高水平和高活性蛋白酶的获得，使得Cas蛋白活性得到高效发挥。

技术领域

本发明属于生物基因技术领域，具体的，涉及一种高纯度CRISPR-Cas9蛋白的酶切方法。

背景技术

CRISPR/Cas9系统目前已经迅速成为科研和医学领域最具潜力的基因编辑工具，该基因编辑系统最大优势在于只需要设计一个靶向目标序列的sgRNA(single-guide RNA)就能引导Cas9核酸酶结合到特定的基因序列,并指导Cas9核酸酶切割相应的结合位点,进而完成对靶基因的编辑。但传统的CRISPR/Cas9技术所获得的蛋白纯度和浓度低，酶切方案没有特异性,致使酶切效率不稳定,影响胶回收率以及后续实验。

本实验通过优化Cas9基因，设计不同的载体和纯化方案，获得高表达量、高纯度和浓度的蛋白，并通过改变酶切体系大小,以及酶切反应时间,胶回收率及测序检测的方法验证最佳酶切条件,最后通过荧光定量PCR和Western blotting实验检测目的基因的表达量,确认是否成功敲除目的基因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高纯度CRISPR-Cas9蛋白的酶切方法。

本发明需要解决的技术问题为：

传统的CRISPR/Cas9技术所获得的蛋白纯度和浓度低，酶切方案没有特异性,致使酶切效率不稳定,影响胶回收率以及后续实验。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种高纯度CRISPR-Cas9蛋白的酶切方法，包括以下步骤：

第一步、载体构建：合成RGP基因，并克隆至自行改造pGreat-M载体，完成载体构建，进行条件优化，筛选最优单克隆；

第二步、载体蛋白表达和纯化：使用组合形纯化标签His+MBP+TEV+Cas9进行载体蛋白表达和多步纯化条件优化；

第三步、高浓度和纯度纯化方案设计：即使用自行优化的培养基培养，MBP柱进行纯化，His-TEV酶进行酶切，再通过Ni柱反筛，分子筛和离子柱多步纯化，获得高纯度和浓度的Cas9蛋白，并进行HPLC检测；

第四步、基因敲除酶切体系条件构建和效率优化：包括SSA活性检测、体外切割活性验证、内源活性检测。