[发明专利]糖蛋白的糖链游离法

说明书

一种从糖蛋白游离出糖链的方法，其包括使包含(a)羟胺类和(b)碱性试剂的反应液与所述糖蛋白接触而获得从所述糖蛋白游离出的糖链与所述反应液的混合液的工序。

本申请是申请日为2017年9月26日、申请号为201780059475.X、发明名称为“糖蛋白的糖链游离法”的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种糖蛋白的糖链游离法。本申请基于2016年9月27日于日本申请的专利申请2016-187961号主张优先权，并将其内容援引于此。

背景技术

以抗体医药等生物医药品为代表，大多数蛋白质键合有糖链。在生物医药品中，糖链被指出不仅影响其医药品的活性，还影响抗原性、代谢动力，糖链的分析在生物医药品开发中成为了重要的课题。并且，糖蛋白的糖链能够用作与疾病相关的生物标志物，但为了发现能够成为标志物的糖链，需要分析包含在多样本的生物试样中的糖蛋白的糖链。

并且，在厚生劳动省的《抗体医药品的品质评价指南》中记载有如下内容：从抗体医药品的投药量多的情况或非人型糖链含量根据生产中使用的细胞有可能变得比以往例多的情况考虑，在键合有非人型糖链的情况下，应明确其比例，并且考虑对安全性的影响。因此，在糖链分析中，需要注意不可忽略在人体中不存在的糖链结构，具体而言为N-羟乙酰神经氨酸或Galα1-3Gal结构等。

为了分析糖链，通常首先从糖蛋白游离出糖链，并进行脱盐、除蛋白质等后处理之后，利用质量分析仪分析该糖链，或者对游离出的糖链附加荧光标记并利用配备有荧光检测器的高速液相色谱法、毛细管电泳或它们的组合进行分析。从糖蛋白游离出糖链在任一情况下均成为第一阶段。糖链与蛋白质的键合可分为N-乙酰葡糖胺通过N-糖苷键与蛋白质的天冬酰胺残基的氨基连结的N键型糖链、N-乙酰半乳糖胺通过O-糖苷键与丝氨酸及苏氨酸残基的羟基连结的O键型糖链。为了从蛋白质游离出糖链，使用各自适合的方法。

为了游离出N键型糖链，能够利用PNGaseF或糖肽酶A等酶游离出糖链，但由于底物特异性分别不同，因此需要根据分析对象的生物种类区分使用酶。并且，通常为了提高酶反应的敏感性，预先实施对蛋白质进行改性或利用蛋白酶分解等前处理。

并且，还有通过化学反应游离糖链而不使用酶的方法。例如，在专利文献1中公开有一种将充分干燥的糖蛋白溶解于无水肼，并在100℃加热处理10小时以上的肼分解法，该方法主要用作游离N型糖链的方法。反应后减压蒸馏无水肼，进一步利用碳酸氢钠和乙酸酐进行乙酰化。由于肼还会将与糖链键合的N-乙酰基、N-甘脲基分解而转化为氨基，因此这是通过乙酰化还原的操作。因此，将原本键合有N-甘脲基等其他酰基的情况也全部作为N-乙酰体进行分析。

并且，例如，在专利文献2中还报告有利用水合肼的糖链游离。由于与肼相比，水合肼的处理比较容易且廉价，因此该方法用于大量处理糖蛋白的情况等。然而，该方法与肼分解法同样地需要反应后的肼蒸馏、再乙酰化等后处理。

关于O键型糖链的游离，未发现具有实用性的酶。因此，一直仅利用通过化学反应的游离。作为用于游离的化学反应，广泛使用在强碱水溶液中使糖链β脱离的方法。然而，游离出的糖链在碱的存在下会立即被分解，因此通常使用通过在硼氢化钠的共存下进行反应而将游离出的糖链立即还原为糖醇的方法。

在游离出的糖醇中，用于附加荧光标记的糖链侧的官能团即醛基被还原而转化为醇，因此无法附加荧光标记。因此，通常在将糖醇的所有羟基甲基化(完全甲基化)的基础上利用质量分析仪进行分析。

在专利文献3中公开有一种如下体系：在基于强碱的β脱离中，为了以保存醛基的状态获得O键型糖链，使碱溶液与试样溶液在流路内流动的同时进行短时间反应后立即进行中和处理。

作为以保存醛基的状态以化学方法游离出O键型糖链的其他方法，已知有上述肼分解法。反应后进行肼蒸馏、再乙酰化，并在附加荧光标记之后，利用HPLC等进行分析。