[发明专利]一种表达IBDV VP2蛋白的重组腺病毒及制备与应用

权利要求书

1.一种表达IBDV VP2蛋白的重组腺病毒的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：

(1)提取IBDV的基因组，通过PCR扩增获得IBDV的VP2基因片段；

(2)取穿梭质粒pAdTrack-GOI用Xho I和Sal I进行双酶切，将IBDV的VP2基因片段与穿梭质粒pAdTrack-GOI的双酶切产物进行同源重组，得到穿梭质粒pAdTrack-GOI-VP2；

(3)用限制性内切酶Pme I线性化穿梭质粒pAdTrack-GOI-VP2，然后将线性化的穿梭质粒pAdTrack-GOI-VP2与携带了腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细胞进行菌内同源重组，得到重组腺病毒载体pAd-VP2；

(4)用限制性内切酶Pac I线性化重组腺病毒载体pAd-VP2，然后将线性化的重组腺病毒载体pAd-VP2转染HEK293A细胞，得到表达IBDV VP2蛋白的重组腺病毒rAd-VP2。

2.根据权利要求1所述的一种表达IBDV VP2蛋白的重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中PCR扩增的引物为Ho-VP2-F和Ho-VP2-R，所述引物5’端分别带有20bp与穿梭质粒pAdTrack-GOI双酶切产物同源的同源臂；

各引物序列分别如下：

Ho-VP2-F：

5’-TCTTATCTAGAAGCTTAGGCTCGATTAACGGAGGGCACGAATGA-3’；

Ho-VP2-R：

5’-TAGAGATCTGGTACCGTCGAATGACCAACCTCCAAGACCA-3’。

3.根据权利要求2所述的一种表达IBDV VP2蛋白的重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中PCR反应体系如下：

模板 1μL；

Ho-VP2-F 1μL；

Ho-VP2-R 1μL；

5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μL；

PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1μL；

纯化水 补足至50μL；

PCR反应条件为：95℃预变性3min，98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸90s，总共34个循环，最后68℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述的一种表达IBDV VP2蛋白的重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤(2)中穿梭质粒pAdTrack-GOI的双酶切体系如下：

双酶切条件为：37℃反应2h。

5.根据权利要求1所述的一种表达IBDV VP2蛋白的重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤(2)中同源重组体系如下：

同源重组条件为：37℃反应30min。

6.根据权利要求1所述的一种表达IBDV VP2蛋白的重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤(3)中用限制性内切酶Pme I线性化穿梭质粒pAdTrack-GOI-VP2的酶切体系如下：

酶切条件为：37℃反应2h。

7.根据权利要求1所述的一种表达IBDV VP2蛋白的重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤(4)中用限制性内切酶Pac I线性化重组腺病毒载体pAd-VP2的酶切体系如下：

酶切条件为：37℃反应3h。

8.一种表达IBDV VP2蛋白的重组腺病毒，其特征在于：通过权利要求1～7任一项所述的方法制备得到。

9.权利要求8所述的重组腺病毒在制备IBDV亚单位疫苗中的应用。