[发明专利]一种表达IBDV VP2蛋白的重组腺病毒及制备与应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种表达IBDV VP2蛋白的重组腺病毒及制备与应用。通过PCR扩增IBDV的VP2基因片段与穿梭质粒pAdtrack‑GOI的双酶切产物进行同源重组得到穿梭质粒pAdTrack‑GOI‑VP2，将穿梭质粒线性化后与携带了腺病毒骨架质粒pAdEasy‑1的BJ5183感受态细胞进行菌内同源重组得到重组腺病毒载体pAd‑VP2；最后将pAd‑VP2线性化后转染HEK293A细胞得到重组腺病毒rAd‑VP2。本发明重组腺病毒rAd‑VP2纯化后滴度可达6.72×10⁹GFU/mL，接种动物后能够有效刺激特异性抗体的产生，为IBDV亚单位疫苗的研发奠定一定的基础。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种表达IBDV VP2蛋白的重组腺病毒及制备与应用。

背景技术

鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)引起的一种高度接触性禽类传染病。临床上3-6周龄雏鸡易感IBDV，其特征性病变为法氏囊肿胀，出血坏死，该病发病率高且病程发展迅速，死亡率高达20％甚至100％，而且IBDV主要侵害法氏囊中不成熟的B淋巴细胞，因此IBDV还会引起鸡群的免疫抑制，使得鸡群易感其他机会病原以及造成免疫失败，目前，该病已发展成为与鸡新城疫、鸡马立克病并列的三大危害家禽健康的传染病。

IBDV属于双RNA病毒科禽双RNA病毒属，基因组由A、B两个节段的双股RNA组成，A片段编码VP5蛋白和多聚蛋白，多聚蛋白随后被与其共转译的VP4裂解产生VP2、VP4和VP3蛋白，B片段仅编码VP1蛋白。其中VP2和VP3是IBDV主要结构蛋白，VP3含有群特异性抗原表位，但研究表明VP3蛋白不能诱导中和抗体的产生，VP2蛋白是IBDV主要的宿主保护性抗原，可诱导中和抗体的产生，是目前IBDV疫苗研究和开发的主要候选基因。

起初，IBD灭活苗和弱毒苗对IBD能够起到很好的防控作用，但20世纪80年代IBDV变异株和IBDV超强毒株的出现使得IBDV的防控日益艰巨，直到今天，母源抗体的干扰仍然是IBD活疫苗面临的巨大挑战，但有研究发现表达IBDV VP2蛋白的活病毒载体疫苗在母源抗体存在的情况下其免疫效力并未受到影响。

重组腺病毒是基因传递和表达的有效载体，与其他病毒载体相比，腺病毒载体具有宿主范围广，转导效率高，滴度高，瞬时表达等优点，利用该载体构建动物源性和人源性的重组疫苗是目前的研究热点。最常用的腺病毒载体为人腺病毒2型和人腺病毒5型，利用复制缺陷型人5型腺病毒表达IBDV VP2蛋白对IBDV亚单位疫苗的研发具有重要意义。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种表达IBDV VP2蛋白的重组腺病毒的制备方法。本发明方法首先通过PCR扩增IBDV的VP2基因片段，然后与穿梭质粒pAdtrack-GOI的双酶切产物进行同源重组得到穿梭质粒pAdTrack-GOI-VP2，再用线性化的穿梭质粒pAdTrack-GOI-VP2与携带了腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细胞进行菌内同源重组得到重组腺病毒载体pAd-VP2；最后将线性化的重组腺病毒载体pAd-VP2转染HEK293A细胞得到重组腺病毒rAd-VP2。

本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的重组腺病毒。

本发明的再一目的在于提供上述重组病毒在制备IBDV亚单位疫苗中的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种表达IBDV VP2蛋白的重组腺病毒的制备方法，包括如下制备步骤：

(1)提取IBDV的基因组，通过PCR扩增获得IBDV的VP2基因片段；