[发明专利]一种肠源外泌体的制备方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肠源外泌体的制备方法。本发明提供的肠源外泌体的制备方法包括：培养Caco‑2细胞、脂多糖刺激、加药、超速离心、收集外泌体等步骤。本发明提供的肠源外泌体的制备方法具有材料来源易得，成本低廉，操作简单，提取工艺环节简便的优点，该制备方法还可以增加外泌体的浓度，提高产率。同时，采用本发明的肠源外泌体的制备方法制得的肠源外泌体对缓解肠道炎症具有很好的效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肠源外泌体的制备方法。

背景技术

外泌体(Exosomes,Ex)是由各种细胞分泌的微小囊泡，其可以由体内或体外培养的细胞分泌，同时也存在于精液、尿液、腹水、乳汁、血清等人体体液中。外泌体具有独立且完整的磷脂双分子层结构，其含有蛋白质、microRNA等物质而被认为是潜在的新兴的临床诊疗的生物标志物，可以揭示来源细胞的生理信息, 为临床诊断提供新方法。因此，越来越多的高浓度、高纯度的外泌体分离方法或提取方法的研究和报道出现。

专利文献CN108865983A公开了一种细胞外泌体的提取方法，其包括以下步骤：(1)上清液分离：将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；(2)一次提取：将步骤(1)所述培养上清液与外泌体提取液混合后进行孵育，孵育后得第一孵化液，对第一孵化液进行离心浓缩，得到含外泌体的浓缩液；(3)二次提取：将步骤(2)所述含外泌体的浓缩液加入无菌PBS溶解后加入外泌体提取液进行孵育，孵育后得第二孵化液，将第二孵化液进行离心收集底部沉淀，得细胞外泌体。该提取方法可以有效地提高细胞外泌体的纯度，降低其杂蛋白含量。

专利文献CN108918228A公开了一种血清或血浆中的外泌体制备试剂盒及外泌体制备方法，所述试剂盒包括外泌体提取试剂，所述外泌体提取试剂为亲水聚合物或亲水聚合物的溶液；所述亲水聚合物包括PEG、硫酸葡聚糖、PVP中的一种或几种的组合，利用该试剂盒得到的外泌体粒径分布更集中，使得外泌体的杂质更少，纯度更高。

专利文献CN109554341A公开了一种采用无创超声处理细胞，通过对细胞进行一定的刺激，调控细胞外泌体中的microRNA的表达丰度，和/或潜在的提高脑源神经营养因子的表达，和/或促进有害蛋白从脑内清除，和/或减轻有害物质对脑组织的氧化损伤。该方法可以在短时间内即可得到目标外泌体，而且可以实现多种microRNA表达丰度的同时提升，可以得到更多microRNA表达改变的外泌体。

专利文献CN110343664A公开了一种从人体体液或者细胞的培养液中提取外泌体及外泌体蛋白的方法。该方法包括：向含有外泌体的待提取液中加入提取材料提取得到外泌体；提取材料为金属氧化物或修饰有所述金属氧化物的功能材料；金属氧化物能与磷酸根离子发生双配位作用；所述待提取液为来源于人体的体液、所述体液的稀释液或细胞的培养产物。该提取方法可以实现对人体体液或细胞的培养液中外泌体的高效提取，提取时间短，获得的外泌体纯度高，可以通过洗脱液洗脱获得完整的外泌体。

专利文献CN112322584A公开了一种简便的外泌体提取方法，包括以下步骤：(1)收集外泌体细胞上清液；(2)通过离心去除上清液中的细胞碎片；(3)将去除细胞碎片的上清液转移到超滤管中，使用超滤管富集外泌体；(4)使用PBS对超滤管中富集的外泌体进行洗涤；(5)对洗涤后的外泌体进行盐析，得到相对纯化的外泌体；(6)测定纯化后外泌体的浓度。该方法利用滤过膜截流外泌体，再通过盐析析出大分子量蛋白，解决了外泌体提取困难的问题，提高了外泌体的提取质量和提取效率。

然而，目前的外泌体制备方法一般是基于外泌体独特的密度、尺寸等物理学参数实现提取，缺乏特异性，无法满足特定样品特异性外泌体的提取和分析要求，从而妨碍了外泌体后续研究分析的进程。肠道是维持人体正常生理活动的重要器官之一，参与机体物质代谢、防御屏障、细胞体液免疫、分泌活性物质等重要功能，一旦出现炎症将严重影响人体健康，因此，研究和开发出新的有效的治疗肠道炎症的方法具有重大的意义。

发明内容