[发明专利]一种胚胎脊髓体外培养体系、胚胎脊髓体外缺氧损伤模型的建立方法及应用

说明书

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种胚胎脊髓体外培养体系、胚胎脊髓体外缺氧损伤模型的建立方法及应用。本申请中通过对培养基的各种成分进行筛选、调整、组合且对数值范围进行研究，同时协同配合从大量生物亲和性滤膜中进行选择，以及相应的培养操作过程，最终实现了胚胎脊髓在体外的不同时间长度下(1周和3周以上)存活生长。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种胚胎脊髓体外培养体系、胚胎脊髓体外缺氧损伤模型的建立方法及应用。

背景技术

儿童脑室周围白质软化症(Periventricular Leuko-malacia，PVL)是缺血缺氧性脑病的一种后期改变，并且是造成早产儿脑瘫(主要是痉挛性下肢瘫或四肢瘫)的主要原因，PVL是一种继发性脑白质病，见于早产儿及产后窒息的存活儿童，由于缺血缺氧性脑实质损伤，引起脑室周围白质软化，导致双侧痉挛性偏瘫、四肢瘫、智能低下。由于脑白质软化患儿的缺氧是在出生后发生的，一般胚鼠的脊髓需要培养到胚胎期E19.5-E21.5(小鼠孕期19-21天)左右进行缺氧处理，且缺氧损伤之后再生一般需要14天以上，所以在模拟脑白质软化的缺氧损伤和再生过程时就需要长时间(20天以上)对胚鼠的脊髓进行培养。

但是，目前的现有技术中在小鼠胚胎脊髓体外培养中仅能够实现3-6天的短期培养。因此，建立小鼠胚胎脊髓体外长期培养技术具有重大意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种胚胎脊髓体外培养体系、胚胎脊髓体外缺氧损伤模型的建立方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种胚胎脊髓体外长期培养体系，包括培养基和生物亲和性滤膜，所述培养基为5％explant culture medium：DMEM/F12+5％FBS+P/S+Glucose，培养基中Glucose浓度为6.5mg/ml；其中P/S包括青霉素(P)50ug/ml及链霉素(S)25ug/ml；

所述生物亲和性滤膜为White FHLC Membrane。

一种胚胎脊髓体外短期培养体系，包括培养基和生物亲和性滤膜，所述培养基为1％explant culture medium：DMEM/F12+1％FBS+1％N2+2％B27+15nM T3+P/S+Glucose；培养基中Glucose浓度为6.5mg/ml；其中P/S包括青霉素(P)50ug/ml及链霉素(S)25ug/ml；

所述生物亲和性滤膜为Mixed Cellulose Esters Membrane。

如上述的一种胚胎脊髓体外长期培养体系或体外短期培养体系在胚胎脊髓体外培养中的应用，所述胚胎脊髓体外培养的方法包括将食品级不锈钢环放置孔板内，并加入体外培养的培养基，将胚胎脊髓从背侧分开，平摊在生物亲和性滤膜上，室管膜部分朝上，将生物亲和性滤膜放置于孔板的钢环上，37℃，5％二氧化碳、氧气供应充分状态漂浮培养，隔天半换培养基。

一种胚胎脊髓的体外缺氧损伤模型的建立方法，包括：将胚胎期E13.5时期的小鼠脊髓按照上述的胚胎脊髓体外培养的方法培养，体外培养2天后进行缺氧处理，2天后恢复正常氧浓度，继续长期培养即可，可继续培养至少17天。

如上述的一种胚胎脊髓的体外缺氧损伤模型的建立方法在建立脊髓缺氧损伤模型中的应用。

如上述的一种胚胎脊髓的体外缺氧损伤模型的建立方法在髓鞘发育再生研究中的应用。

如上述的一种胚胎脊髓的体外缺氧损伤模型的建立方法在脊髓缺氧损伤再生药物筛选中的应用。

进一步地，所述应用的应用方法中，药物筛选过程中药物的使用时间为恢复正常氧浓度后一天进行药物干预，继续培养16天后，进行相关参数的检测。如可以检测培养组织内髓鞘化程度，从而了解药物对髓鞘再生的影响。