[发明专利]一种URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型及其构建方法与筛选方法

权利要求书

1.一种URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型，其特征在于，该细胞模型是携带且能表达如SEQ ID NO.1所示的hURAT1基因的细胞系。

2.根据权利要求1所述的URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型，其特征在于，所述细胞系为HEK293T细胞。

3.一种如权利要求1-2任一项所述的URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型的构建方法，其特征在于，报如下步骤：

(1)对质粒采用限制性内切酶进行酶切，然后将如SEQ ID NO.1所示的hURAT1基因连接在质粒上，得到包含hURAT1基因的质粒；

(2)将步骤(1)所述包含hURAT1基因的质粒转染至细胞系中，得到转染后的细胞系，经过药物筛选、DNA鉴定及蛋白质鉴定，得到能稳定表达hURAT1基因的细胞系，该细胞系即为所构建的URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型。

4.根据权利要求3所述的URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述质粒为pEGFP质粒；所述质粒包含嘌呤霉素的抗性基因；所述限制性内切酶为限制性内切酶AclI，所述限制性内切酶的酶切位点不在所述嘌呤霉素的抗性基因上。

5.根据权利要求3所述的URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述药物筛选包括：将所述转染后的细胞系置于含嘌呤霉素的完全培养基中进行筛选培养，筛选培养后，选出能在含嘌呤霉素的完全培养基中存活的细胞系；所述筛选培养的时间为6-8天；所述嘌呤霉素在完全培养基中的浓度为1-2μg/mL。

6.根据权利要求3所述的URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述DNA鉴定为：在DNA水平上证实hURAT1基因已经稳定整合到细胞中；所述DNA鉴定为PCR鉴定。

7.根据权利要求3所述的URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述蛋白质鉴定为：在蛋白质水平上证实转染后的细胞系能表达hURAT1基因；所述蛋白质鉴定方法为蛋白免疫印迹法。

8.一种URAT1抑制剂体外活性筛选的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)实验组：在容器内将待测药物、荧光素加入培养基中，接种所述URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型，得到混合液，进行共培养处理，吸走培养基，得到实验组处理后的细胞；

(2)对照组：在容器内将荧光素加入培养基中，接种所述URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型，得到混合液，进行共培养处理，吸走培养基，得到对照组处理后的细胞；

(3)分别裂解步骤(1)所述实验组处理后的细胞和步骤(2)所述对照组处理后的细胞，然后分别采用荧光分光光度法进行测试，得到实验组的荧光分光光度值、对照组的荧光分光光度值；

(4)当实验组的荧光分光光度值小于对照组的荧光分光光度值时，则判断步骤(1)所述待测药物为URAT1抑制剂，且差距越大，则抑制作用越强；当实验组的荧光分光光度值等于对照组的荧光分光光度值时，则判断步骤(1)所述待测药物不是URAT1抑制剂。

9.根据权利要求8所述的URAT1抑制剂体外活性筛选的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)所述荧光素为5-羧基荧光素、6-羧基荧光素、Pyranine中的一种；在，步骤(1)和步骤(2)所述混合液中，荧光素的浓度为50-500μmol/L；步骤(1)和步骤(2)所述URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型的接种密度为4×10⁴-10×10⁴cells/well；步骤(1)和步骤(2)所述共培养处理的温度为25-37℃，共培养处理的时间为5-90min。

10.根据权利要求8所述的URAT1抑制剂体外活性筛选的方法，其特征在于，步骤(1)所述待测药物为经过细胞毒性后的药物，所述待测药物对所述URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型无毒；在混合液中，所述待测药物的浓度为5μmol/L-5000μmol/L。