[发明专利]一种URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型及其构建方法与筛选方法

说明书

本发明公开了一种URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型及其构建方法与筛选方法。该构建方法包括：将hURAT1基因连接在质粒上，将质粒转染至细胞中，经过药物筛选、DNA鉴定及蛋白质鉴定，得到URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型。该筛选方法，包括：将待测药物、荧光素加入培养基中，接种上述细胞模型，进行共培养，除去培养基，得到培养后的细胞，裂解，测试荧光分光光度值，根据荧光分光光度值来判断待测药物是否URAT1抑制剂。与现有的通过放射性标记¹⁴C‑尿酸的方法相比，本发明的方法具有高灵敏度、定量、高特异性，对设备与测试环境要求不高，可避免放射性污染等优点，且可用于高通量筛选URAT1抑制剂。

技术领域

本发明涉及药理学及基因工程领域，具体涉及一种URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型及其构建方法与筛选方法。

背景技术

尿酸是人体嘌呤代谢的产物，在自然界中，通常只有人类、鸟类及某些灵长类以尿酸为嘌呤代谢的最终产物，由于缺乏将尿酸进一步分解成为可溶性尿囊素的酶，人类很容易发生高尿酸血症。人体尿酸在肝脏中形成，约1/3经肠道排泄，约2/3经肾脏排泄。研究发现肾脏尿酸盐转运的经典模式为：肾小球的滤过，肾小管的重吸收，肾小管的分泌，分泌后的重吸收。肾小球滤过的尿酸98％以上被近端肾小管重吸收然后再分泌，故肾小管是影响尿酸排泄量的重要因素。

URAT1也被称为尿酸盐转运体或尿酸盐阴离子交换器，主要表达于肾近端小管的顶膜，首次被发现于2002年。URAT1主要参与尿酸在肾小管近端的重吸收，在尿酸的重吸收过程中起到重要作用。抑制URAT1可减少肾脏对尿酸的重吸收，促进尿酸的排泄，使血浆尿酸浓度降低，从而达到治疗痛风和高尿酸血症的目的。近年来，URAT1抑制剂成为了目前降尿酸药物开发的热点，不断有新的小分子被发现可能具有URAT1的抑制活性。现已上市的URAT1抑制剂包括丙磺舒、磺吡酮、苯溴马隆、lesinurad等。

验证未知小分子化合物是否具有药理活性，即建立药物体外或者体内活性评价筛选模型是探索和发现新药的首要条件之一。为进行促尿酸排泄化合物的早期筛选和开发新型降尿酸药物，构建降尿酸药物药效评价细胞模型尤为重要。

细胞和分子水平模型是进行体外药物筛选的常用模型，它们具有快速检测、灵敏度高、假阳性低、经济的特点，尤其适合于药物的高通量筛选。目前，以URAT1为药物作用靶点的高尿酸血症治疗药物的体外筛选研究主要在细胞水平上进行。主要的细胞模型有肾小管细胞包括肾小管上皮细胞(HK-2)、狗肾细胞(MDCK)、小鼠肾细胞(RTECs)、HEK293细胞等，但不论哪种细胞模型，均是采用¹⁴C标记的尿酸为放射性底物，基于放射免疫原理，开展活性检测。此放射性同位素方法虽然具有灵敏度高的优点，但其使用成本高昂并且对环境有害，操作者在使用时还应采取特殊的安全预防措施，避免污染和处置废物。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型及其构建方法与筛选方法。

本发明的目的在于提供一种URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型，该细胞模型是一种非放射性、减少环境污染的、且更容易普及的体外活性评价模型，为研究URAT1抑制剂提供一种新的体外活性筛选方法，为新药的研发提供新途径。

本发明的另一目的在于提供基于上述URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型进行的URAT1体外活性评价的应用方法。

本发明提供的基于荧光分光光度法的体外活性筛选方法，用于检测尿酸盐转运蛋白1(URAT1)与小分子的相互作用，筛选出以URAT1为靶点的活性化合物。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明提供的URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型，该细胞模型是携带且能表达如SEQ ID NO.1所示的hURAT1基因的细胞系。所述hURAT1基因购自上海捷瑞生物工程有限公司(Catalog No.:EX-T4563-Lv105)。