[发明专利]一种快速检测鲤春病毒血症病毒的方法

权利要求书

1.一种快速检测鲤春病毒血症病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，取待测样本，加入释放剂，置于焦点区域并传输1-80MHz的聚焦声能装置中，3-10min后，得到核酸液；

S2，向核酸液中加入逆转录酶浓缩缓冲液、dNTP、随机引物、RNA酶抑制剂、AMV逆转录酶，40℃-42℃反应20-40min，合成cDNA模板；

S3，通过cDNA模板建立RT-RPA反应体系，得到扩增产物；

S4，将扩增产物进行稀释5-10倍，并通过胶体金试纸条进行检测。

2.如权利要求1所述的一种快速检测鲤春病毒血症病毒的方法，其特征在于：步骤S1中，温度为40-60℃，释放剂的pH值为6-9。

3.如权利要求2所述的一种快速检测鲤春病毒血症病毒的方法，其特征在于：所述释放剂包括洗涤剂5-30％、缓冲液30-120mM、离液剂5-20M、螯合剂20-100mM；

所述缓冲液为HEPES、TRIS、MOPS、PIPES、SSC、MES和磷酸盐的一种或两种以上的组合物；

所述离液剂为硫氰酸胍盐、异硫氰酸胍盐、盐酸胍盐、甲酰胺、高氯酸锂、三氯乙酸钠、尿素的一种或两种以上的组合物；

所述螯合剂为EDTA、DTPA、EDDS、NTA和膦酸盐的一种或两种以上的组合物；

所述洗涤剂包含为N-月桂酰基肌氨酸、十二烷基硫酸钠、Triton-X-100，N-辛基--D-吡喃葡萄糖苷、CHAPS、N-辛基--D-吡喃麦芽糖苷，N-辛基--D-硫代吡喃葡萄糖苷和Tween20的一种或两种以上的组合物。

4.如权利要求3所述的一种快速检测鲤春病毒血症病毒的方法，其特征在于：所述释放剂还包括蛋白水解酶0.1-2mg/mL和金属盐1-20mM，所述金属盐为氯化钾或氯化钠。

5.如权利要求1-4任意一项所述的一种快速检测鲤春病毒血症病毒的方法，其特征在于：所述释放剂包括以下组分：N-月桂酰基肌氨酸1-10％，Tween20 5-20％，TRIS 30-120mM，EDTA 30-100mM，蛋白水解酶0.1-2mg/mL、氯化钠5-15mM、硫氰酸胍盐2-10M、尿素3-10M。

6.如权利要求1所述的一种快速检测鲤春病毒血症病毒的方法，其特征在于：所述聚焦声能装置为便携式装置，所述聚焦声能装置单次可处理50-100μL溶液；所述聚焦声能的峰值强度功率为100-300W，周期为100-300。

7.如权利要求1所述的一种快速检测鲤春病毒血症病毒的方法，其特征在于：

步骤S3中，RT-RPA反应体系包括噬菌体重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、引物和探针。

8.如权利要求7所述的一种快速检测鲤春病毒血症病毒的方法，其特征在于：

所述引物序列如下：

SVCV-RPA-F1：5'-biotin-GTCTTGTCGAATGAAATTCTGTAATAAAGATGG-3'，

SVCV-RPA-R1：5'-biotin-CTTTTAGTCCCCTCACACAAAGTATATTCTACC-3'。

9.如权利要求8所述的一种快速检测鲤春病毒血症病毒的方法，其特征在于：

所述探针序列如下：

5'-FITC-GGTAGAAAAAACAGCTGGAACATTGACGAATA-FAM-dT-THF-BHQ1-dT-ATGCAAATATACCTGAA-C3-3'；

其中，FAM-dT：携带荧光素的胸腺嘧啶核苷酸；THF：四氢呋喃残基；BHQ1-dT：携带淬灭基团的胸腺嘧啶核苷酸；C3：阻断物。

10.如权利要求1所述的一种快速检测鲤春病毒血症病毒的方法，其特征在于：步骤S4中，所述胶体金试纸条包括PVC背板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，样品垫、金标垫、吸水纸依次粘贴到PVC背板的相应位置，所述硝酸纤维素膜上喷涂有检测线和质控线，所述金标垫上喷涂金标抗FITC抗体，所述检测线喷涂avidin蛋白，所述质控线喷涂抗兔抗体。